EP-15A3在熒光定量PCR測定HBV-DNA精密度和正確度驗證中的應用*

李育敏，張水蘭，闞麗娟，湯花梅，熊 丹，許曉清，李方勇，張秀明

(深圳市羅湖區人民醫院醫學檢驗科，廣東深圳 518001)

臨床實驗室在引進新的測量程序，檢測患者標本及出具患者檢測報告之前必須對檢測方法的分析性能進行評估。按照ISO 15189:2012和CNAS-CL36:2012《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》[1]，定量檢測方法和程序的分析性能驗證應包括精密度和正確度。2014年10月發布的美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI) EP15-A3《用戶精密度驗證和偏倚評估實驗——批準指南》為臨床實驗室提供了最新的驗證廠商聲明的測量程序精密度和正確度簡便、有效的方法[2]。目前國內對CLSI EP15-A3用于臨床分子診斷測量程序的性能驗證報道較少，本研究按照EP15-A3方案對熒光定量PCR法測定乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)進行精密度驗證和偏倚評估，為EP15-A3在臨床分子診斷定量檢測方法和程序分析性能驗證的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1樣本測定 樣本為北京康徹思坦生物技術有限公司提供的HBV-DNA標準物質，高濃度水平(4.60E+06 IU/mL)批號為201609003，低濃度水平(1.41E+03 IU/mL)批號為201607003。按照廠家說明書進行分裝保存于-15 ℃以下。

1.2試劑與儀器 試劑為湖南圣湘生物科技有限公司提供的HBV-DNA熒光定量PCR試劑盒(批號2017012) 。儀器為羅氏cobas?z480全自動熒光定量PCR分析儀。

1.3方法

1.3.1測定流程樣本檢測前校準儀器，每天進行室內質量控制，質控在控時數據可接受。按照EP15-A3要求，選擇高、低2個濃度水平樣本，每個樣本重復測定5次，持續5 d，每個樣本得到25個數據。

2 結 果

2.1離群值檢驗 將HBV-DNA檢測原始結果轉換成對數值后進行數據分析，以便使數據更符合正態分布，消除指標度量單位不同造成的不良影響。用Grubbs′法計算高、低2個濃度水平樣本所有測定結果對數值均在Grubbs′限值內，無離群值。2個水平測定結果對數值的最大值和最小值見表1。

2.2精密度驗證 高濃度水平的SR(CV，0.87%)≤σR(CV，5.00%)、SWL(CV，1.60%)≤σWL(CV，5.00%)；低濃度水平的SR(CV，3.79%)≤σR(CV，5.00%)、SWL(CV，4.83%)≤σWL(CV，5.00%)，精密度驗證通過，見表2。

表1 Grubbs′法計算熒光定量PCR法測定HBV-DNA的離群值結果(Log IU/mL)

表2 熒光定量PCR法測定HBV-DNA的精密度驗證結果(Log IU/mL)

表3 熒光定量PCR法測定HBV-DNA的偏倚評估結果(Log IU/mL)

2.3偏倚評估 高濃度水平均值為6.54 Log IU/mL，在VI(6.28～7.04 Log IU/mL)內；低濃度水平均值為3.04 Log IU/mL，在VI(2.74～3.56 Log IU/mL)內，正確度驗證通過，見表3。

3 討 論

精密度是指在規定條件下，對同一或類似被測對象重復測量所得值或測得值間的一致程度，反映測量結果隨機誤差的大小，通常用不精密度表示[3]。精密度是檢測系統的基本分析性能之一和其他方法學性能評價的基礎，如果精密度差，則無法進行其他方法學性能評價。在CLSI的精密度評價指南中，EP10-A3是用于同時進行線性、偏倚、精密度和樣本攜帶污染的初步評價[4],EP5-A3用于測量程序的精密度性能確認及驗證[5]。EP15-A3僅用于驗證已經建立的檢測方法精密度性能，而不適用于未建立精密度聲明的新方法分析性能的確認，主要為臨床實驗室提供一個簡便、有效、可行的方法來驗證實驗室的不精密度是否與廠家聲明的一致，也適用于能力驗證失敗后或者質量檢測未通過，對實驗方法改進或校正后再次進行精密度驗證。性能指標為SR和SWL。SR是指在一系列相同的測定條件下獲得的不精密度。測定條件包括相同的測定方法，相同的操作者，相同的測量系統，相同的操作條件，相同的地點，在一段較短的時期中重復測定相同或相似的分析物。SWL是指在規定的時間內和相同的操作者使用相同的儀器設備，校準和試劑可以是變化的，得到的不精密度。

正確度是指無限多次重復測量的平均值與真值的一致程度，反映測量結果系統誤差的大小，通常用偏倚來度量[6]。用于正確度評價的CLSI指南有EP9-A3和EP15-A3。EP9-A3采用至少40份患者樣本進行測量程序比對和偏倚評估，適用于實驗室引進新的檢測系統或方法，更換新試劑或新儀器，與原有檢測系統或參考方法進行比對，評價兩個檢測系統或方法測定結果的偏倚是否在可接受范圍內[7]。廠商或實驗室開發新的測量程序，最好使用EP9-A3進行比對及偏倚評估。EP15-A3采用有值參考物質進行偏倚評價，比對定值和測定結果，其樣本數量、重復次數及統計學處理較EP9-A3簡單，適用于臨床實驗室進行測量程序的正確度確認和驗證。有值參考物質包括有證參考物質、參考方法定值分析物、PT和EQA定值分析物，這些物質也適用于精密度驗證。性能指標為相對偏倚，即實驗室確定允許偏倚，評價測量偏倚是否在允許偏倚范圍內。

與EP15-A2相比，EP15-A3首先在重復測定次數上增加到5次，使重復性更可靠，其次，采用Grubbs′法進行離群值檢驗，使離群值判斷更簡單客觀。第三，偏倚評估不再采用患者樣本進行兩種方法的比較，僅利用有值參考物質進行比對，使驗證方法更簡便。第四，在偏倚評估數據分析中，EP15-A2判斷參考物質靶值是否在測量均值驗證區間內，EP15-A3則判斷參考物質測量均值是否在靶值驗證區間內，提高統計學效能[2，8]。

本研究按CLSI EP15-A3指南，對熒光定量PCR法測定HBV-DNA進行精密度驗證和偏倚評估。Grubbs′法檢驗無離群值。高、低濃度水平樣本檢測均SR≤σR，SWL≤σWL，表明不精密度符合廠家聲明要求，精密度驗證通過；高、低濃度水平測量均值均在VI內，表明測量偏倚與允許偏倚不具有統計學差異，測量偏倚在允許偏倚范圍內，正確度驗證通過，說明該測量程序能夠滿足臨床需求。目前，國內報道EP15-A3多用于臨床化學和免疫測量程序的性能驗證[9-10]。本研究以HBV-DNA檢測為例，將EP15-A3應用于臨床分子診斷定量檢測方法和程序的精密度和正確度驗證，供同行參考。