藥食同源果樹歐李分子水平研究進(jìn)展

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(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué),山西 太谷 030801；2. 晉中學(xué)院,山西 榆次 030019)

藥食同源植物是經(jīng)過多年、甚至數(shù)百年數(shù)千年食用而被證實對人體有益無害，適合普通人群長期食用的物種。《本草綱目》中記載的藥食同源果樹有烏梅、桑葚、沙棘、橘、杏仁、桃仁、酸棗仁、棗、荔枝、郁李仁等。歐李仁在傳統(tǒng)中藥中一直作為郁李仁的種仁出現(xiàn)，含苦杏仁甙(amygdalin)、脂肪油、皂甙等；性平，味辛、苦、甘；潤腸通便，利水消腫，用于腸燥便秘，小便不利，腹?jié)M喘促，腳氣，浮腫。歐李的果實可食用，營養(yǎng)豐富 ，其含營養(yǎng)種類之多，含量之高，優(yōu)于櫻桃、李、杏、桃等核桃類果品。其中維生素VA、VB2、VB12、VC、VE；微量元素含量豐富，果肉中鈣含量達(dá)524 mg/kg，鮮種種仁鈣含量達(dá)3 743 mg/kg[1,2]；含有包括賴氨酸在內(nèi)的19種氨基酸、多肽、不飽和脂肪酸、γ-氨基丁酸和神經(jīng)酸等；果實中多酚類物質(zhì)含量豐富，包括單寧類、酮類、花色苷及酚酸類等等，因此歐李具有很強(qiáng)的抗氧化活性及清除自由基的能力，有很好的保健價值。目前，通過人工馴化已培育出‘農(nóng)大3號’‘農(nóng)大4號’‘農(nóng)大5號’‘農(nóng)大6號’‘農(nóng)大7號’‘燕山1號’‘京歐1號’‘蒙原早豐’‘蒙原早紅’等鮮食和加工品種。隨著生活質(zhì)量的提高人們已不再滿足“有病能治好”，更多希望“根本不得病”，與大宗水果相比更青睞于藥食同源果品，因此歐李的應(yīng)用前景廣闊。

1 歐李的研究現(xiàn)狀

1.1 主要研究方向

通過對281篇發(fā)表的文獻(xiàn)和碩士、博士論文的閱讀分析和實踐調(diào)查，可知學(xué)術(shù)工作者和生產(chǎn)實踐者從形態(tài)到功能、從栽培到采后、從品質(zhì)到代謝、從生態(tài)到發(fā)展、從遺傳到分子水平對歐李進(jìn)行了研究。概括出目前對歐李的研究主要集中在以下方面：1)歐李的形態(tài)特征，2)歐李的生物學(xué)特性，3)歐李的抗性研究，4)歐李的生態(tài)適應(yīng)性和生態(tài)學(xué)效應(yīng)，5)歐李的栽培與育種，6)歐李果實品質(zhì)及抗氧活性研究，7)歐李的營養(yǎng)成分分析，8)歐李內(nèi)含物的提取條件，9)歐李快繁技術(shù)，10)外源物質(zhì)對歐李代謝的影響，11)歐李推廣的可行性分析與對策，12)歐李采后貯藏與加工，13)歐李遺傳變異分析，14)歐李基因型鑒定，15)歐李基因檢測與功能表達(dá)，16)歐李酶活性研究，17)歐李多肽的制備及活性研究，18)歐李可持續(xù)發(fā)展研究。

1.2 基因克隆方面

目前對歐李基因的克隆主要有線粒體基因、葉綠體基因和核基因，這些基因涉及到物質(zhì)代謝和能量代謝基因、通道蛋白基因、自交不親和基因。這些基因的克隆有助于我們對歐李從亞顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究與分析。目前已克隆基因為：

1)克隆葉綠體相關(guān)基因與歐李抗逆性的改良、糖原和支鏈淀粉的形成、光呼吸、氨基酸形成機(jī)制、生物多樣性的分析和光保護(hù)機(jī)制等有關(guān)，如：1 928bp DNA 歐李 NADH脫氫酶亞基F(ndhF)基因，部分CD；728bp DNA 歐李克隆bop002867淀粉分支酶(SBEI)基因CDS部分；879bp DNA 歐李克隆bop002867假定RF1蛋白(YCF1)基因部分CDS；1015bp DNA 歐李克隆bop002867 RuBP羧化/加氧酶大亞基(rbcL)基因；1 234bp DNA 歐李克隆bop002867 tRNA的賴氨酸(trnK基因)基因部分序列；和成熟酶K(MATK)基因，部分CD；1 803bp mRNA 歐李葉綠體紫黃素脫環(huán)氧化酶(VDE)mRNA、完整的CDS。

2)克隆線粒體相關(guān)基因與歐李抵御低溫脅迫的能力有關(guān)，如：1 559bp mRNA 歐李線粒體交替氧化酶(AOX)mRNA、完整CDS產(chǎn)品的核基因。

3)克隆水通道蛋白基因?qū)τ诶没蜓芯扛牧歼x育高質(zhì)優(yōu)產(chǎn)品種具有重要的意義，如：2 245 bp DNA歐李水通道蛋白PIP2(PIP2)基因，完整的CD。

4)克隆核糖核酸酶基因利于揭示歐李新的進(jìn)化機(jī)制和功能分化，如：889 bp DNA 歐李S7核糖核酸酶基因CDS部分；309 bp DNA 歐李S3核糖核酸酶(S3)基因部分CDS；684 bp DNA歐李S4核糖核酸酶(S4)基因部分CDS；266 bp DNA 歐李自交S1核酸酶(S1)基因，s1-s基因CDS部分；806 bp DNA 歐李自交不親和S6核糖核酸酶基因，部分CD； 441 bp DNA歐李自交不親和S5核糖核酸酶基因，部分CD。

5)與抗逆性有關(guān)的克隆基因有1 872 bp mRNA歐李液泡H + - ATP酶催化亞基mRNA，完整的CD等等。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)歐李種質(zhì)創(chuàng)制與利用山西省重點(diǎn)實驗室現(xiàn)已克隆出了歐李花色苷基因、油脂基因、有機(jī)酸相關(guān)基因、糖代謝基因及凝集素基因，這些基因的克隆有助更好的對歐李進(jìn)行分子水平的研究，對開發(fā)其藥食同源功能提供更好的基礎(chǔ)。

1.3 蛋白水平方面

結(jié)合基因克隆研究者對基因進(jìn)行了原核表達(dá)，誘導(dǎo)其表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，如：NADH脫氫酶亞基F部分、水通道蛋白PIP2、 NAD依賴型蘋果酸脫氫酶、液泡H + - ATP酶催化亞基、NAC轉(zhuǎn)錄因子、葉綠體紫黃素脫環(huán)氧化酶、線粒體交替氧化酶、淀粉分支酶，部分(葉綠體)、假定1蛋白部分(葉綠體)、isphosphate羧化酶/ xygenase大亞基，部分(葉綠體)、S7 RNase，部分、SRNase，部分、SRNase，部分、S4 RNase，部分、S3的RNase，部分、核糖核酸酶，部分、自交不親和S1-RNase，部分、自交不親和S2-RNase，部分、自交不親和性S6 RNase，部分、自交不親和性的S5 RNase，部分等，并對這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，這有助于在蛋白水平上對歐李進(jìn)行研究，更好的了解其功能。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)歐李種質(zhì)創(chuàng)制與利用山西省重點(diǎn)實驗室對其克隆的基因構(gòu)建了相應(yīng)的表達(dá)載體，下一步的研究中誘導(dǎo)其表達(dá)，進(jìn)行免疫學(xué)研究和功能檢測。同時可以多肽研究和開發(fā)功能蛋白，將其作為保健食品和功能食品，進(jìn)一步開發(fā)藥物或探針用于醫(yī)學(xué)研究。

2 歐李果實食用與保健價值

歐李果實中有機(jī)酸含量1.0%～2.0%，是提取天然有機(jī)酸，也是改進(jìn)高糖少酸飲料，制作健康飲料的首選原料。歐李有機(jī)酸的主要成分為蘋果酸，果實酸度為蘋果酸決定型，蘋果酸含量高占到總酸含量的比率為69.78%～86.21%，是一種獨(dú)特的保健水果[3]，L-蘋果酸為天然果汁之重要成分，與檸檬酸相比具有酸度大，但味道柔和，具特殊香味，不損害口腔與牙齒，代謝上有利于氨基酸吸收，不積累脂肪，是新一代的食品酸味劑，被生物界和營養(yǎng)界譽(yù)為“最理想的食品酸味劑”。999bp mRNA歐李NAD依賴型蘋果酸脫氫酶基因，完整的CD；1 779bp mRNA 歐李NADP-蘋果酸酶mRNA的表達(dá)，完整的CD已被克隆，L-蘋果酸在生物體代謝過程的作用和意義，顯著的生理功能機(jī)制更好的被揭示。L-蘋果酸中含有天然的潤膚成分，能夠很容易地溶解粘結(jié)在干燥鱗片狀的死細(xì)胞之間的“膠粘物”，從而可以清除皮膚表面皺紋，使皮膚變得嫩白、光潔而有彈性；L-蘋果酸可以用于治療肝病、貧血、免疫力低下、尿毒癥、高血壓、肝衰竭等多種疾病，并能減輕抗癌藥物對正常細(xì)胞的毒害作用；還可用于制備和合成驅(qū)蟲劑、抗牙垢劑等。歐李種質(zhì)資源豐富，今后應(yīng)開展多種種質(zhì)材料中代謝酶與積累機(jī)制的研究。

歐李果實中酚類物質(zhì)含量豐富，平均值為7.30～13.0 mg/L，果皮中含量最高，果肉次之，果汁中含量最低[4]，多酚是一類天然抗氧化劑和自由基清除劑，具有抗輻射、抗衰老、抗腫瘤、抗血脂等藥理作用[5,6]。歐李仁多肽具有抗氧化作用，對DPPH·自由基的清除作用隨濃度的增加幾乎曾直線上升，IC50為2.69 mg/ml[7]。

目前從歐李花色苷中分離出6種花色苷類組分：矢車菊-3-葡萄糖苷、天竺葵-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-鼠李糖葡萄糖苷、天竺葵-3-鼠李糖葡萄糖苷、矢車菊-3-乙酰基葡萄糖苷、天竺葵-3-3乙酰基葡萄糖苷，矢車菊-3-葡萄糖苷占花色苷總量的62.6%[8]。花色苷屬于黃酮類化合物，是一種分布廣泛的天然色素，具有抑制血小板凝固，預(yù)防心臟病、血栓，抗癌[9]，抗氧化[10]，防止肝損傷等多種生理功能。歐李種仁平均含油率為41.5%，其中不飽和脂肪酸為96.29%，主要成分為油酸68.53%和亞油酸27.43%[11]，穩(wěn)定好易被人體吸收，能阻止氧化自由基對血管的危害，并且能增進(jìn)消化系統(tǒng)，促進(jìn)骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。

3 歐李凝集素的研究

植物凝集素是指能可逆結(jié)合特異單糖或寡糖的蛋白或糖蛋白，而且具有廣泛的細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)功能。由于其特殊的糖蛋白結(jié)構(gòu)特征，也可用于新陳代謝疾病方面的診斷。植物凝集素不僅存在于種子，根、莖、葉、皮、果實中也發(fā)現(xiàn)有凝集素。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物凝集素1 000多種，存在于豆科、茄科、大戟科、本科、百合科和石蒜科等眾多植物類群中，因此對新的凝集素的篩選也是一項重要的工作。現(xiàn)在對凝集素的研究更具體到了物種家族，雙孢菇凝集素家族、藍(lán)藻病毒蛋白家族、橡膠蛋白、榴蓮凝集素、苦參凝集素家族，通過分離鑒定，對他們的性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)以及家族凝集素的不同功能，蛋白單體到寡聚體的組裝過程作了大量的研究，許多工作已深入到基因水平。

歐李是一種備受關(guān)注且取得開發(fā)應(yīng)用價值的優(yōu)質(zhì)野生果樹資源，其營養(yǎng)價值豐富。課題組經(jīng)過多年的研究已將其很好的應(yīng)用與生產(chǎn)實踐，在分子水平的研究方面已完成轉(zhuǎn)錄組的測定，亟待對其基因進(jìn)行深層次的研究。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)歐李種質(zhì)創(chuàng)制與利用山西省重點(diǎn)實驗室對歐李凝集素CH-lectin基因進(jìn)行克隆、氨基酸序列比對和蛋白結(jié)構(gòu)、功能預(yù)測：歐李凝集素基因全長為2 404bp；用Blast對該基因序列搜索，得到目標(biāo)序列與桃的相關(guān)基因序列高度同源，一致性達(dá)到96%；它編碼一個全長800個氨基酸的蛋白質(zhì)；其N端的19個氨基酸是信號肽，能夠以親水性分泌性蛋白形式表達(dá)，分子量為90.37kDa；蛋白二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲；該蛋白亞細(xì)胞定位于葉綠體(類囊體膜)，含有一個甘露糖結(jié)合位點(diǎn)，二聚體結(jié)合位點(diǎn)，ATP結(jié)合位點(diǎn)，活性位點(diǎn)，多肽低物結(jié)合位點(diǎn)和活化環(huán)，預(yù)測其屬于酪氨酸激酶，為甘露糖結(jié)合凝集素，而且與半刀豆凝集素有相似的結(jié)構(gòu)域。甘露糖結(jié)合凝集素對腫瘤細(xì)胞有很好的誘導(dǎo)凋亡作用，半刀豆凝集素具有潛在的抗肝癌作用。歐李是薔薇科野生果樹，而且歐李是具有觀賞價值的雙子葉藥食同源植物，目前對薔薇科凝集素、雙子葉植物凝集素的研究很少，這項研究恰好可以填補(bǔ)這一空白，開發(fā)出一種新型的凝集素基因家族，為醫(yī)學(xué)事業(yè)的發(fā)展做出重要貢獻(xiàn)。隨著凝集素數(shù)據(jù)庫的建立，糖鍵結(jié)構(gòu)的分析，糖鍵合成的方法學(xué)，糖識別機(jī)制的闡明，歐李凝集素的結(jié)構(gòu)將更加清晰，將有助于推動免疫學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，更有助于歐李藥用價值的開發(fā)研究。

歐李作為藥食同源植物之一，其栽培面積、產(chǎn)量、市場需求量不斷擴(kuò)大；新的品種不斷培育(鈣果系列、鮮食品種、加工品種、綠化品種)；加工產(chǎn)品種類不斷增多(果啤、果酒、飲料、罐頭等)；功能產(chǎn)品不斷研發(fā)(食用油、茶葉、原漿酒等)；特別是從基因和蛋白角度對其的研究力度的加大(能量代謝、物質(zhì)代謝、信息代謝)，更加有助于我們開發(fā)藥用產(chǎn)品，治療免疫疾病，神經(jīng)疾病及腫瘤疾病等。因此進(jìn)行“歐李、健康、生態(tài)”主題研究有利于以人為本，有利于可持續(xù)發(fā)展。