射頻消融技術聯合TACE誘導肝癌細胞凋亡的機制

邢燕來 王曉磊

目前對原發性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC)的治療仍以外科治療為主，但是其術后并發癥較多，患者預后狀況較差[1-2]。射頻消融技術(radiofrequency ablation，RFA)將射頻電極插入腫瘤中并輸出能量，提高細胞內的溫度至90℃，從而毀損腫瘤細胞[3-4]。TACE術(transcatheter arterial chemoembolization)多用于治療肝癌[5-6]。新型長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度超過200 核苷酸(nucleotide，nt)的調節性非編碼 RNA，其在肝癌、喉癌和直腸癌中起關鍵作用[7-8]。本研究即探討新型長鏈非編碼RNA在肝癌中潛在的生物學功能和機制。

資料與方法

一、研究對象

選取2014年1月至2015年12月期間來我院就診的185例肝癌患者作為研究對象。所選185例肝癌患者中男性患者105例，女性患者80例，年齡48～78歲，平均年齡(64.30±5.17)歲。所有參試者均自愿簽訂同意書，配合參加本次研究。受試者分為試驗組和對照組，試驗組(n=95)實施冷循環射頻術聯合TACE術，對照組(n=90)實施傳統手術切除。入選標準：臨床診斷肝癌患者；無其他腫瘤疾病及免疫系統疾病病史；其他身體指標符合正常標準。剔除標準：近期做過大型手術；接受過放療或者化療等治療方法；不能配合完成試驗者。本研究已經獲得醫院醫學倫理委員會批準，且受試者均已簽署書面知情同意書。

二、治療方法

(一)受試者實施冷循環射頻術聯合TACE術。即先給予患者TACE治療，使用Seldinger 行股動脈穿刺插管，于DSA下實施腫瘤供養動脈造影，選取吡喃阿霉素60 mg、碘化油30 mL混合乳化物行栓塞治療，然后導管灌注卡鉑300 mg。TACE治療1周后，再進行RFA 減瘤治療(LDRF-120S射頻消融治療儀)。RFA針刺入腫瘤中心，消融針展適合直徑，行重疊消融減瘤治療，消融范圍延伸周邊正常組織1 cm位置。收集患者的肝癌組織標本，采用熒光定量檢測的方法得到患者癌組織標本的RNA表達量[7-8]。對照組實施傳統手術切除腫瘤組織。

(二)采用應用q-PCR檢測(美國 Primerdesign公司Q-PCR試劑盒；用GAPDH基因作為內參)方法檢測患者癌組織標本的長鏈非編碼RNA- AK054978及長鏈非編碼RNA- FER1L4在肝癌患者肝癌組織及癌旁組織中的表達水平。熱循環采用Tach-down程序：94℃ 5 min -(94 ℃ 20 s ～ 65 ℃ 1 min ～ 72 ℃ 2 min)1個循環,然后退火溫度每循環降低1℃ ,降至61℃時進行36個循環。設定在每個循環72℃延伸后期收集熒光數據。熱循環完成后進行60℃～95℃的融解曲線測定。

(三)構建長鏈非編碼RNA- AK054978及長鏈非編碼RNA- FER1L4的質粒，分別電轉染SMMC-7721人體肝癌細胞株(美國ATCC公司)。運用Transwell 小室(德國 默克密理博公司)實驗檢測肝癌細胞的組織生物學特性，對比分析癌細胞轉染后組織細胞遷移和細胞侵襲能力。Transwell 小室上室面用 Matrigel(50 mg/L)按 1∶8 稀釋液包被后以 FN 涂抹在小室下面并干燥，紫外線消毒 30 min。各孔加入 1% BSA 無血清培養基 0.1 mL，Matrigel充分浸潤后吸掉殘余培養基。制備細胞懸液，將細胞濃度調整為 1×106個/mL，細胞懸液 0.2 mL(1×105)加于預包被培養板各孔，于下室緩慢加入 10 % FBS 培養基 0.5 mL，溫箱培養 16 h。用棉簽將 Transwell 小室上室面未穿過基底層膜的細胞擦去，注意不要破壞基底層膜，顯微鏡下進行計數細胞并比較。通過流式細胞儀(北京博奧CytoNova系列流式細胞儀)檢測各組肝癌細胞凋亡變化[7-8]。將待測細胞制成單細胞懸液，離心棄上清，沿管壁緩慢加入700 mL/L預冷 (-20 ℃)乙醇固定，上機檢測前RNA酶消化，再加入PI染色液，4 ℃避光30 min，使用FCM檢測凋亡率及細胞周期。

三、統計學處理

結 果

一、試驗前，對所有肝癌患者的基本臨床資料進行調查統計，試驗組(n=95)，性別(男/女)為50/45，平均年齡為(50.32±8.96)歲；分化程度低者18例、分化程度中者32例、分化程度高者45例，淋巴轉移陽性者60例、淋巴轉移陰性者35例，遠處轉移陽性者51例、遠處轉移陰性者44例；對照組(n=90)，性別(男/女)為47/43，，平均年齡為(48.85±9.62)歲，分化程度低者16例、分化程度中者28例、分化程度高者46例，淋巴轉移陽性者57例、淋巴轉移陰性者33例，遠處轉移陽性者47例、遠處轉移陰性者43例。各組受試者的一般情況進行比較，結果顯示無統計學差異(P>0.05)。此外，研究過程中所有受試者均完成了全部試驗，無中途退出者，亦無改用其他療法者。

二、TACE聯合射頻消融治療后CT顯示：射頻消融后復查，見病灶大范圍壞死，但是腫瘤內側及外側均見結節狀強化，提示腫瘤有殘余。新型長鏈非編碼RNA(lncRNA)在肝癌患者癌組織中的表達量高于與其對應的癌旁組織。經過β-actin均一化后，得到兩種lncRNA在不同組織中的相對定量(ΔCt= Ct lncRNA-Ct β-actin)。試驗組(n=95)：AK054978(Ct)為35.35，FER1L4(Ct)為25.15，β-actin 為18.32，AK054978(ΔCt)為17.03±5.21，FER1L4(ΔCt)為6.83±4.23；對照組(n=90)：AK054978(Ct)為32.26，FER1L4(Ct)為30.36，β-actin 為19.01，AK054978(ΔCt)為13.25±4.87，FER1L4(ΔCt)為為11.35±4.22。對比AK054978、FER1L4在兩種組織中的表達差異，肝癌組織中AK054978的表達明顯提高，屬于上調型(P<0.01)，相反，FER1L4的表達顯著下降，屬于下調型(P<0.01)。

三、對肝癌患者癌組織的生物學功能進行檢測，發現AK054978 轉染組：細胞增殖(OD)為6.92，細胞凋亡(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)為1.68，發生細胞遷移者為50例，發生細胞侵襲者為38例；FER1L4轉染組：細胞增殖(OD)為3.89，細胞凋亡(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)為1.04，發生細胞遷移者為0例，發生細胞侵襲者為0例，即長鏈非編碼RNA- AK054978可以加速肝癌中細胞的繁殖，增強細胞遷移、侵襲能力；通過流式細胞儀觀察發現AK054978 轉染組凋亡率低、FER1L4轉染組凋亡率高，即上調長鏈非編碼RNA- AK054978的表達可以減少肝癌細胞凋亡。

討 論

RFA具有創傷很小，療效比較確切，并發癥少，住院時間短[9-10]。TACE可阻斷腫瘤的絕大多數血供，致使腫瘤缺氧，抑制腫瘤生長、促使腫瘤壞死[11]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度超過200nt的RNA分子，lncRNA被轉錄在腫瘤的發生發展中起關鍵作用。lncRNA多具有內在的RNA介導的功能轉化[12]。

ACE聯合經皮肝穿射頻消融術(RFA)可明顯提高患者的1年和2年生存率；經TACE聯合經皮肝穿射頻消融術治療后患者的中位生存期明顯長于單獨TACE治療的患者，說明TACE聯合經皮肝穿射頻消融術可在一定程度上延長患者的生命。

新型長鏈非編碼RNA在肝癌患者癌組織中的表達量高于與其對應的癌旁組織，與TNM分期、細胞分化、淋巴結的轉移有密切的關聯。為了研究新型長鏈非編碼RNA在肝癌中的潛在生物學功能特性及其分子機制，研究者建立兩種RNA表達量不同的肝癌穩定轉染細胞，其中AK054978的表達明顯提高，屬于上調型；FER1L4的表達顯著下降，屬于下調型。將兩種RNA細胞分別導入癌細胞組織中，運用流式細胞技術、細胞劃痕實驗檢測肝癌細胞的組織生物學特性，發現上調lncRNA可以加速肝癌中細胞的繁殖，增強細胞遷移、侵襲能力。利用自噬抑制劑3-MA，通過流式細胞儀觀察兩種細胞的凋亡情況，發現上調RNA的表達可以使肝癌中細胞發生自我吞噬從而減少細胞凋亡；經倒置電子顯微鏡觀察發現：下調RNA表達量的穩轉細胞，細胞形態發生了變化，有逆轉的趨勢。長鏈非編碼RNA不僅只具有基因組轉錄的功能，還具備重要的細胞和分子生物學功能。其可通過影響基因組的轉錄過程和表觀遺傳信號改變腫瘤的發生發展，潛在的分子生物學功能主要有：調控蛋白活性、改變RNA的模式、調節轉錄模式等。

綜上所述，長鏈非編碼RNA的表達與肝癌的產生和發展有著密不可分的聯系；冷循環射頻聯合TACE通過抑制新型長鏈非編碼RNA表達誘導肝癌細胞凋亡。