多囊卵巢綜合征模型的構建與分析

□亓妍妍 孟 欣 張 琳 門肖霞 賈新銳 齊萬學

多囊卵巢綜合征(PCOS)又名Stein-Leventhal綜合征，系下丘腦-垂體-卵巢軸功能失調引起的生殖障礙與代謝異常并存的內分泌紊亂綜合征。其主要表現為持續無排卵、胰島素抵抗、高雄激素血癥及高胰島素血癥。患者多呈現月經稀發、量少，甚則閉經、不孕而就診，除此之外還常伴有肥胖、多毛、黑棘皮癥及痤瘡等，嚴重的則可能引起乳腺癌、子宮內膜癌和心腦血管等疾病。目前絕大多數PCOS實驗都使用大鼠作為理想動物模型[1]，因其規律且較短的動情周期(4～5d)以及價格便宜可以大規模使用，常用的大鼠有SD和Wistar兩種。本文集合了近年來多位研究者從不同生理病理學角度、采用不同的造模方法建立的接近人類PCOS某些病情特征的動物模型，現將各種多囊卵巢綜合征大鼠模型綜述如下。

一、雄激素造模法

(一)丙酸睪丸酮模型。丙酸睪酮(TP)為一類雄激素類藥物，而高雄激素表現如多毛、痤瘡等都是PCOS的主要臨床特征，這就給我們以提示：高雄激素血癥會使該疾病的基本內分泌改變，而高雄激素水平也可能是導致PCOS的病因之一。所以丙酸睪酮模型就是通過外源注射高雄激素來達到干擾卵泡的生長成熟，進而出現不排卵的目的。

盛哲津等[2]將脂溶性藥物丙酸睪酮溶于中性茶油中，且將5～6日齡雌鼠，隨機分組，對照組小鼠皮下注射中性茶油溶液50μL，注射1次，建模組小鼠頸背部皮下注射丙酸睪酮溶液50μL(1mg丙酸睪酮)。NTO組(給予中性茶油的對照組小鼠)及丙酸睪酮處理模型小鼠(PCOS組)均飼養于標準化的SPF級實驗動物房內。檢測結果顯示雖然模型鼠的糖代謝正常，但其基礎血糖值較對照組有所升高(P<0.05)，模型小鼠出現陰道上皮細胞持續角化、交配見栓率、妊娠率顯著低于對照組，模型組胰島素水平雖有所升高卻與對照組無顯著性差異。卵巢卵泡和正常卵巢相比明顯成多囊樣發育，見囊狀擴張卵泡。LH、FSH都處于低水平(<0.1U/L)，血游離睪酮水平較對照組顯著升高(P<0.05)，孕酮水平較對照組顯著降低(P<0.01)。以上這些結果表明此次建模部分模擬了人PCOS的臨床特點，因此，該方法制備的多囊卵巢綜合征小鼠動物模型可以應用于不孕癥以及多囊卵巢等的實驗研究。總體來說該造模方法的優點是模型持續時間長(>3個月)且操作簡便，利于臨床實驗動物的觀察。缺點是成模時間不確定，卵巢形態學結果不足以作為成模的依據。

(二)脫氫表雄酮模型。研究發現，大部分PCOS患者多在青春期時便表現出腎上腺分泌雄激素增多，脫氫表雄酮硫酸鹽(DHEAS)和血清脫氫表雄酮(DHEA)水平升高。推測可能DHEA的升高是導致PCOS的一個重要原因[3]。脫氫表雄酮是睪酮生物合成中的一個中間產物，經△5途徑合成睪酮，如通過外源途徑提升DHEA水平也可以造成雄烯二酮水平增高，而睪酮及雌酮水平的升高，就會導致卵泡發育停滯，從而發生排卵障礙。

李燕等[4]將大鼠從23日齡開始：對照組皮下注射油劑(注射用茶油，下同)，注射量為0.2mL/100g；造模組每天早晨于頸背部皮下注射脫氫表雄酮溶液(濃度為30mg/mL，注射量為0.2mL/100g體重)，連續注射20d。經檢測得知從23～43日齡，SD雌大鼠體重約為50～150g，所以注射液用量應在0.1～0.3mL之間浮動。其結果顯示造模組卵巢表現出閉鎖卵泡增多、多囊樣改變、閉鎖卵泡直徑明顯大于對照組。造模組血清空腹血糖水平、FSH、T及體質量等方面都明顯升高(P<0.05)。綜上所述，該模型的優點是該法更接近PCOS的發病機制，造模周期相對較短(20d)，解決了丙酸睪丸酮造模時間過長(>3個月)的問題，且重復性較好，能很好地模擬人PCOS卵巢生理和形態學改變，是當今國內外常用的建模方法。但其缺點也在于DHEA的原料藥不溶于水，以往文獻采用的造模方法均為DHEA溶于注射用油進行皮下注射，但油劑皮下吸收較緩慢進而導致注射部位形成硬結，會影響藥物的進一步吸收。由于人PCOS與通過外源注射雄激素所建立起來的動物模型在對治療的反應、形態及激素改變等許多方面都有很大差別，故停用DHEA后恢復排卵的周期仍有待進一步商榷。

(三)硫酸普拉睪酮鈉模型。張娟等[5]用DHEA硫酸鈉鹽制劑硫酸普拉睪酮鈉9mg/100g/日皮下注射23日齡雌性大鼠20d，結果顯示經硫酸睪酮鈉皮下注射20天后，其卵巢重量顯著升高，卵泡的囊性擴張數變多，卵泡內放射冠或卵母細胞逐漸消失，至于顆粒細胞層則變薄甚至消失，其細胞排列呈現松散狀態，卵泡膜細胞出現增生；血清E2、T濃度明顯增加。說明本實驗模型無論從病理學形態變化，還是血清激素水平都與多囊卵巢綜合征病人相似，故可作為一種較理想的用于研究多囊卵巢綜合征的動物模型。

二、孕激素聯合人絨毛膜促性腺激素(HCG)造模法

該方法是基于Bogovich等[6]在1989年首先采用的模型。國內朱亮等[7]也對其進行了研究，具體造模過程為：選取24日齡SD雌性大鼠，模型組將左旋18-甲基炔諾酮硅膠棒皮下埋植注入，3mm/只，3d后(27日齡)開始皮下注射人絨毛膜促性腺激素1.5×103U/L，一天兩次。對照組在第27日開始每天皮下注射等體積生理鹽水，注射9d后觀察。結果顯示模型組大鼠卵巢皮質內的各發育期黃體及卵泡少見，卵巢表面呈現蒼白狀態；可見呈囊性擴張的卵泡，其內部的放射冠或卵母細胞消失；卵泡膜細胞和間質細胞增生；顆粒細胞層數減少為2～3層，且排列疏松。由電鏡可見卵泡膜內E2變化不明顯而大量睪酮、血清孕酮、脂滴等卻明顯增高。模型組大鼠血清空腹血糖(FBG)值、空腹胰島素(FINS)值、HOMA指數均明顯高于對照組(P<0.05，有統計學意義)。究其方法機制為用避孕硅膠棒可抑制下丘腦-垂體-卵巢軸，使性激素分泌速率變低，導致不排卵。而HCG在各方面都比LH(促黃體生成素)更強，進而使原來的正常內源性促黃體生成素脈沖式分泌模式遭到破壞，最終使SD大鼠的血清睪酮明顯增加。因目前尚無LH制品，HCG的生物作用和化學結構與LH類似，故聯合使用HCG來造PCOS動物模型。對于優點可以總結為：皮下埋植劑緩慢、恒定的釋放，實驗周期短、重復性好且操作簡單。該方法在于雖未使LH水平顯著升高，卻使大鼠模型同時具備了胰島素抵抗、雄激素水平升高和LH/FSH升高這三大PCOS典型生理病理改變，這是極其關鍵的。而缺點就在于可能影響促排卵藥物的治療效果，不適合促排卵藥物的藥效研究。

三、胰島素(INS)聯合人絨毛膜促性腺激素(HCG)造模法

本方法由Poresky[8]創建，他在前人[9]基礎上發現高胰島素的環境可促使LH樣作用下的囊性卵泡和卵巢體積增長，于是選擇85日齡SD雌性大鼠進行實驗，隨機分組，其中一組每天2次在皮下注射1.5IUHCG；還有一組皮下注射胰島素，于第1～10日從0.5U/d逐漸加量到6.0U/d，并按此劑量維持；另一組同時注射HCG和INS，共注射22d。在第23天斷頭處死，觀察各項常見的PCOS病理生理水平發現單用HCG會發生卵巢的單側或雙側多囊樣改變，有小囊泡生成。單純使用胰島素者雖胰島素水平有些許升高但并未發生PCOS樣改變，而胰島素加HCG則出現了PCOS樣卵巢和無排卵。INS聯合HCG和單用HCG多囊樣改變的發生率分別為80%、60%[10]。該模型的組織學符合人體PCOS改變，并通過HE電鏡觀察陰道涂片從而證實了無排卵；內分泌變化方面則出現了由胰島素引起的持續存在的高胰島素血癥和外源性HCG造成的大鼠體內長期存在的LH樣作用，并由此誘導出高雄激素血癥。其原理在于HCG能抑制卵泡顆粒細胞有絲分裂使顆粒細胞數量變少，而胰島素能刺激卵巢卵泡膜細胞和間質細胞合成雄激素，降低血中SHBG(性激素結合蛋白)含量，從而使雄激素的濃度升高，兩者共同作用下，便出現了高雄激素血癥及卵泡閉鎖，形成多囊癥狀。該方法總體來講具有卵巢多囊性改變，無排卵，體質量升高，血清LH和胰島素顯著增加等PCOS樣特征，是目前國內比較前沿的研究模型，但不足之處在于有排卵存在，見黃體組織較多、囊泡直徑較大，這與PCOS患者的臨床癥狀有些許差異，還不能用于胰島素抵抗方面的研究。

四、芳香化酶抑制劑法

在本造模法中芳香化酶抑制劑主要指的是來曲唑(Letrozole)，它是由Kafali等[11]首次采用非類固醇的芳香化酶抑制劑建立的一種PCOS動物模型。它能用來建模主要是由于芳香化酶是將雄激素轉化為雌激素最后一步的限速酶，它可以將睪酮和雄烯二酮轉變成E2和雌酮。來曲唑作為一種芳香化酶抑制劑能夠抑制雄激素向雌激素的轉換，可導致卵巢生成類固醇激素功能紊亂，產生過多的雄激素，進而引發PCOS癥狀的無排卵和卵泡閉鎖現象。

袁琪等[12]將清潔級6周齡雌性SD大鼠隨機分為兩組，對照組用1%羧甲基纖維素灌胃，模型組則灌服溶于1%羧甲基纖維素的來曲唑，給藥劑量為1mg/kg/d，兩組連續灌服21天。于干預期完之后處死大鼠，經過處理和檢測后發現模型組所有大鼠失去穩定動情周期且均處于間期，其雙側卵巢重量、體質量均增加，卵巢多囊樣發生改變，白膜增厚，與之對應的是黃體數目明顯減少。除此之外，模型組在血清FINS、T、LH等方面水平均顯著高于對照組(P<0.05)，P水平明顯低于正常對照1組，FSH相比之則無統計學意義(P>0.05)。綜合來講，該種模型在內分泌改變還有局部性腺的解剖、組織學改變方面都有獨特的優勢，尤其是在卵巢形態學改變方面有著無可比擬的優勢，是研究多囊卵巢綜合征胰島素抵抗和發病機制令人信服的模型方法之一。而缺點恰恰就在于造模費用高昂，E2水平明顯降低，因此不適合研究雌激素水平較高的PCOS。

五、雌激素造模法

該方法多為戊酸雌二醇(EV)造模法。其理論基礎為高雌激素刺激會導致下丘腦神經元退化，垂體出現代償性增生，使垂體對GnRH刺激的敏感性增加，靜脈推注GnRH也會致使LH升高，而且雌激素的持續刺激更是對垂體FSH有強烈的抑制作用，從而出現PCOS垂體內分泌環境的典型特征。

邵華等[13]采用的是將雌性SD大鼠隨機分為空白組、對照組、低劑量組及高劑量組。空白組不做任何處理；對照組給予一次性肌內注射0.2ml植物油；低劑量組一次性肌內注射含EV2mg的0.2ml油劑；高劑量組一次性肌內注射含EV4mg的0.2ml油劑。于造模后15d、30d、60d各階段每組各處死3只大鼠，取卵巢，HE染色進行觀察。結果顯示高、低劑量模型組均出現動情周期紊亂，其30d后的卵巢表面顏色蒼白，體積變小，卵泡呈現多囊狀擴張。高劑量組比低劑量組的囊狀卵泡體積更大，數量更多，顆粒細胞排列也更不規范。但值得注意的是，血清中睪酮和雄烯二酮水平卻無明顯差異。通過本實驗過程和結果分析可知2mg和4mg都可使大鼠動情周期紊亂且卵巢表現出多囊樣改變，而且隨著油劑在體內緩慢吸收，作用時間延長，卵巢多囊樣改變愈加充分。EV誘導的多囊卵巢大鼠模型在垂體、卵巢、下丘腦的神經生長因子(NGF)表達增多也進一步論證了Elisabet Stener-Victorin等[14]關于交感神經興奮性增加在多囊卵巢形成過程中發揮著重要作用的理論。綜上所述，因本方法的卵巢形態學改變及激素分泌水平與人PCOS相似，雖未見有關于脂、糖代謝失調的研究進展，但可作為以生殖內分泌失調為主的PCOS動物模型。

六、結語

以上為現階段國內外采用比較多的PCOS動物模型建立方法，由于多囊卵巢綜合征是一種臨床表現多態性的疾病，其發病機制的多因性，臨床表現的異質性和復雜性都限制了上述各種造模方法都只能以單方面的特性或者某些方面特性來剖析和構建PCOS模型。由于PCOS是一種高度異質性的疾病，要找到一個能完全模擬人PCOS臨床特點的動物模型也是不太現實的，所以還是應該根據研究目的來選擇合適的模型。另外，研究者們也仍在努力探索和嘗試新的誘導方法，希望能建立更為理想的PCOS動物模型。近年來，人們在內分泌學、形態學等方面的研究力度進一步加深，尤其是對于細胞更深層次的探索，如細胞水平、基因水平等[15]，但尚處于初步探究階段。相信隨著實驗動物學的不斷發展，未來將會建成更為理想、更公認、更符合發病機制的多囊卵巢綜合征大鼠動物模型，從而推動PCOS研究及治療方法的進步。