海洋石油降解厭氧微生物的分離鑒定及降解性能分析

張 美，陳 超，劉 秋

(大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 116600)

1 引言

隨著世界工業的迅猛發展，石油資源被廣泛利用。海上石油資源的開采、運輸，以及石油泄漏事故等事件的頻發，嚴重污染了海洋環境，破壞了海洋系統的生態平衡，威脅了人類的生命健康。在國家海洋局發布的《2010年中國海洋環境質量公報》中顯示，面積約4.8萬km2的近岸局部海域水質較差，劣于第4類海水水質標準，主要超標物質是活性磷酸鹽、無機氮以及石油烴類物質[1]。在環境保護部發布的《2010年中國環境狀況公報》中的海洋環境章節中提到，石油烴類物質是海水中的重要污染物之一，嚴重地威脅了海洋生態平衡；而在渤海，石油類污染源更是被作為主要的污染指標[2]。

至今，石油污染對環境造成的危害已經引起學者的廣泛關注，用于處理石油污染的方法中，微生物修復因其修復費用低，不會造成二次污染等優點[3]，是目前具有廣闊前景的重要修復技術[4～7]。長期以來，人們普遍認為石油烴污染修復只能在好氧條件下進行[8]，因此，研究學者多以好氧微生物為研究對象，對其降解特性、功能基因、代謝途徑進行了系統的研究，取得了一定的研究進展[9～11]。但近年來，國內外的研究表明，厭氧微生物能夠以硝酸鹽、硫酸鹽或金屬離子等為電子受體，參加石油烴的代謝[12]。海底環境屬于低氧甚至無氧狀態，對于海洋極端環境，厭氧微生物或許有著比好氧微生物更重要的微生物修復任務，而對于海洋來源的厭氧石油降解菌的研究，還處于起步階段。

本研究從大連新港石油污染海域海底沉積物中分離獲得4株具有石油降解特性的厭氧微生物，根據16S rDNA基因序列同源性分析，初步確定了4株厭氧菌株的分類地位，并初步研究了4株菌株對原有的降解效果，為今后該屬菌株應用于海洋石油污染的生物修復提供理論基礎。

2 材料與方法

2.1 海洋厭氧石油降解菌的分離篩選

從大連新港石油污染地區采集海底沉積物樣品，樣品采集后，用海水封住上層，立即帶回實驗室，4 ℃保存。使用厭氧菌富集培養基進行富集實驗，厭氧菌富集培養基(改良人造海水培養基(GL-ASM))：NaCl 30 g/L，MgSO40.35 g/L，KH2PO40.2245 g/L，微量溶液(濃縮100倍)100 μL/L，原油含量為150 μL/50mL，刃天青1 mL/L，半胱氨酸0.2 g/L，pH值為7.2左右，每250 mL厭氧瓶中分裝50 mL厭氧菌富集培養基，高溫加壓滅菌(121 ℃，20 min)備用。固體平板分離培養基：上述GL-ASM培養基加瓊脂18 g/L。

待滅菌結束后，取出厭氧瓶立即抽真空，充氮氣(循環抽真空-充氮氣5次)放入厭氧工作臺，在每瓶培養液中加入 2 mL(約2 g)混勻的海洋沉積物樣品。將處于厭氧狀態下的厭氧培養瓶，利用注射器針頭放氣，使厭氧瓶中氣壓與外界保持一致，防止培養過程中有氣體生成造成壓力過大而使厭氧瓶炸裂。于30 ℃培養箱中靜置培養7 d(每組設3個平行實驗)。在固體平板分離培養基上用涂布法進行涂布，培養出單菌落，使用三線法在LB固體培養基上進行擴培，在30 ℃恒溫的厭氧操作臺里培養7 d直至長出菌落，多次劃線分離純化，直至獲得微生物純培養，制備20%甘油水溶液凍存管，于-70 ℃保存備用。LB培養基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值為7.2左右。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 海洋厭氧菌的DNA提取

將純化菌株在LB液體培養基中培養，離心去除上清，沉淀即為菌體。取適量菌體加入TE buffer，加入一定量的溶菌酶(10 mg/mL)，37 ℃溫浴30 min；加入50 μL 55 ℃預熱的20%SDS和蛋白酶K(20 μg/mL)，55 ℃溫浴1 h；加入550 μL的酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1的混合液，震蕩混勻，12000 r/min離心10 min，吸取上清。重復上述步驟一次。加入2倍體積的無水乙醇于-20 ℃放置30 min，12000 r/min離心5 min，去除上清。加入200 μL的70%乙醇清洗DNA，12000 r/min離心5 min。待乙醇揮發干燥后，將DNA溶于50 μLTE buffer中，于-20 ℃保存。

2.2.2 16S rDNA的PCR擴增

合成細菌16S rDNA通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R (5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’)，用于PCR擴增反應，體系如下：ddH2O 37.5μL，10xPCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，DNA 1 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，rTaq酶0.5 μL。PCR反應程序如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共30個循環；72 ℃ 5 min。

2.2.3 系統發育樹的構建

得到菌株的 16S rDNA 堿基序列后進行純化并測序，將測序結果于 NCBI 數據庫中比對分析，用MEGA7[13]軟件構建系統發育樹。

2.2.4 石油降解率的測定

以沸程60～90 ℃的石油醚為溶劑，配置成一系列的石油標準溶液，在紫外分光光度計225 nm處測定吸光值，以光密度為縱坐標，油濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

將4株菌株在LB液體培養基中培養，測定OD600=0.3左右，以5%接種量轉接入50 mL GL-ASM液體培養基中，添加150 μL石油，在30 ℃厭氧恒溫箱里培養7 d，同時設置不添加菌的液體培養基作為空白對照，每組實驗設3次重復。培養結束后，每瓶培養體系中加入20 mL石油醚進行第一次提取，留上層溶液，下層溶液進行第二次提取。第二次萃取加入15 mL石油醚，第三次加入10 mL石油醚；共提取三次。每次提取充分混勻，提取時間為20 min。將三次萃取溶液離心(10000 r/min)，取上相定容至50 mL容量瓶中。取100 μL萃取液溶于4.9 mL的石油醚中，波長225 nm下紫外檢測吸光值。

紫外比色法：225 nm條件下，測定吸光值，根據以下公式進行降解率的計算：

(1)

式(1)中：MC為對照組石油含量(單位：mg)；MO為實驗組石油含量(單位：mg)。

3 結果與討論

3.1 菌株鑒定

對獲得的4株菌株16S rDNA進行測序，并于NCBI上進行比對分析，結果表明4株菌株均屬于Vagococcus屬。使用MEGA7.0對4株菌株進行系統進化樹的構建結果如圖1所示。4株菌株的進化關系較近，與菌株Vagococcus fluvialis CCUG 32704T相似度最高，4株菌株之間處于同一分支，100%自展值表明該支穩定，且4株菌株之間有一定的進化距離，表明4株菌株屬于Vagococcus屬的不同菌株，將菌株分別命名為Vagococcus sp.08，Vagococcus sp.11，Vagococcus sp.26，以及Vagococcus sp.38。其中，Vagococcus sp.11與模式菌株Vagococcus fluvialis CCUG 32704T的進化地位最相近。

圖1 4株菌株16S rDNA序列N-J系統發育分析

3.2 石油降解特性分析

對4株海洋厭氧菌的石油降解能力進行測定，石油降解標準曲線如圖2所示。采用紫外法測定微生物降解后培養基中剩余的石油量，并計算降解率。實驗結果表明，Vagococcus sp.08，Vagococcus sp.11，Vagococcus sp.26，以及Vagococcus sp.38均能以石油為唯一碳源生長，其石油降解率依次為23.78%、31.20%、32.11%和44.31%(圖3)。其中，以Vagococcus sp.38的石油降解性能最高，達到44.31%。

Vagococcus屬是一類獨特的革蘭氏陽性細菌，第一株菌株發現于1989年，并命名為Vagococcus fluvialis(河流漫游球菌)[14]，該屬菌株通常在水生動物體中分離獲得，目前研究主要是針對該菌作為益生菌的潛能開發，如Sorroza L等[15]從不同魚類體內分出50多種細菌，研究發現只有Vagococcus fluvialis能夠較好的抵抗魚類易染病菌，大大提高魚類的存活率，Román L等[16]研究發現Vagococcus fluvialis對研究物種的免疫系統有刺激作用，因此，該菌具有開發成水產益生菌的潛能。本研究首次從石油污染海底沉積物中分離獲得該屬石油降解厭氧微生物菌株，且目前還未有研究報道Vagococcus屬的菌株具有石油降解特性，本研究首次報道了該屬厭氧微生物菌株能夠以石油為唯一碳源生長，證實了其在海洋污染修復治理中的生態作用。

圖2 石油降解標準曲線

圖3 4株菌株石油降解率

4 結論

研究從大連新港石油污染海域海底沉積物中分離獲得4株能夠降解石油的厭氧微生物菌株，經鑒定發現4株菌株均與模式菌株Vagococcus fluvialis CCUG 32704T相似度最高，且4株菌株之間有一定的進化距離。石油降解性能分析發現，4株菌株均具有石油降解特性，首次發現并報道了Vagococcus屬的石油厭氧降解菌。且發現，該屬的4株菌株的石油降解率有所不同，研究表明，雖然菌株進化地位十分相近，但其代謝機制仍有所不同，石油降解性能差異顯著。該結果為今后海洋石油污染的厭氧微生物修復奠定研究基礎。