養殖中華烏塘鱧致病性弧菌的分離鑒定

沈 斌 ，魏 可，殷小龍，楊 瀟，盧德政，鞏 壯，張建設

(1.國家海洋設施養殖工程技術研究中心，浙江舟山 3 160222；2.浙江省舟山市水產研究所，浙江舟山 316000)

中華烏塘鱧Bostrychus sinensis 隸屬于鱸形目Perciformes、塘鱧科Eleotridae、烏塘鱧屬Bostrychus，系河口咸淡水暖水性小型魚類，具有生命力強、生長快、喜穴居等特點[1]。廣泛分布于印度洋北部沿岸至太平洋中部的熱帶、亞熱帶海區，在中國、日本、菲律賓等國家均有分布，我國主要產于南海、臺灣海峽和東海，包括江蘇、浙江、福建、廣東、廣西等省的沿海水域[2]。中華烏塘鱧耐鹽度范圍0～35，耐溫范圍為6～35℃，耐pH 范圍為6.5～9.0；適宜生長的水環境條件：水溫25～30℃，鹽度10～25，pH 7.5～8.5[3]。生理學研究表明，中華烏塘鱧耐干露能力強，干露20 h 不死亡[4]，非常適合活體運輸遠銷。中華烏塘鱧肉味鮮美，營養豐富，具有加速傷口愈合的功效，是名貴的食用魚之一，并作為名貴海產滋補魚類而暢銷深圳、港澳等地[1]。自陳興乾等[5]報道中華烏塘鱧人工育苗成功以來，國內專家學者們在中華烏塘鱧種苗繁育及人工養殖技術方面開展了一系列的研究[6-12]。近年來，廣西、廣東、福建等沿海地區掀起了一股養殖中華烏塘鱧的熱潮，使其成為重要的人工養殖對象[3]。隨著養殖面積的不斷增加，包括腸炎病、赤皮病、弧菌病、寄生蟲病等各種養殖疾病也相繼出現[13-14]，對中華烏塘鱧養殖業造成較大的經濟損失。因此，開展中華烏塘鱧養殖病害方面的研究，對于促進養殖業的可持續健康發展具有重要的意義。

2017年8月，臺州某養殖場的中華烏塘鱧出現皮膚潰瘍病。本研究從患病中華烏塘鱧體內分離出1株優勢菌，通過回歸感染、組織病理切片、生理生化及分子生物學鑒定、藥敏試驗等手段，對患病中華烏塘鱧開展病原學等方面的研究，為該病的診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患病中華烏塘鱧

2017年8月，從浙江臺州某養殖場采集瀕死的5 尾患病中華烏塘鱧(體重約45 g，體長約13 cm)。將患病魚置于冰盒中保存，4 h 內運至實驗室。

1.1.2 健康中華烏塘鱧

人工感染所用的健康中華烏塘鱧購自浙江臺州三門縣某養殖場(體重約50 g，體長約14 cm)。采用尼龍袋充氧、泡沫箱加冰的方式將中華烏塘鱧運輸至實驗室，經10 mg·L-1高錳酸鉀浸泡消毒5 min 處理后，暫養于60 cm×40 cm×60 cm 的玻璃水族箱中，每缸10 尾，海水溫度25℃，鹽度15，pH 8.5。每天換水1次，投餌(新鮮蝦仁)1 次，暫養適應1 周后用于后續實驗。

1.2 病原菌分離

取患病中華烏塘鱧，無菌條件下采集潰瘍部位肌肉組織以及肝臟、脾臟等器官，用無菌1×PBS(pH7.2～7.4，北京索萊寶科技有限公司)沖洗組織塊，剪碎后劃線接種于TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂，青島海博生物技術有限公司)平板上，28℃恒溫培養24 h，挑取優勢菌落進行分離純化，連續純化培養3 代。將純化得到的優勢菌接種于TSB(胰蛋白胨大豆肉湯，青島海博生物技術有限公司)液體培養基擴增，28℃180 r·min-1培養10～12 h。按照菌液:甘油=1:1 的比例，將菌液保存于無菌的50%甘油中，置于-80℃超低溫冰箱保種，菌株編號TZ-01。

1.3 人工感染實驗

將培養12 h 的細菌培養物用無菌1×PBS 制成菌懸液，結合活菌計數法和血球計數板計數法，將菌懸液濃度調整為1×109CFU·mL-1，1×107CFU·mL-1和1×105CFU·mL-1備用。選擇無外傷、活動攝食正常的中華烏塘鱧(體重約50 g)作為供試魚。各實驗組每尾魚胸腔注射0.2 mL 菌懸液，對照組每尾注射0.2 mL 1×PBS，實驗期間不投喂餌料。人工感染后連續觀察14 d，記錄發病和死亡情況。在無菌條件下，用75%酒精棉球對死亡魚體進行體表消毒，利用無菌器械進行解剖，并按照步驟1.2 的方法開展病原菌的再分離。

1.4 病原菌形態與理化特性檢測

將純化后的細菌(TZ-01)分別涂布至TSA 和TCBS(青島海博生物技術有限公司)培養基上，28℃培養24 h 觀察菌落顏色和特征。利用革蘭氏染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)對細菌進行革蘭氏染色，光學顯微鏡觀察。利用法國生物梅里埃公司API-20E 自動鑒定系統中的ONPG、ADH、ODC、CIT、H2S、URE、TDA、VP、GEL、IND、GLU、MAN、INO、SOR、RHA、SAC、MEL、AMY 和ARA 試劑條，按照說明書所述方法進行鑒定。從人工感染發病中華烏塘鱧體內分離得到的優勢菌株同樣采用上述方法進行生理生化鑒定。

1.5 16S rDNA 序列測定和分析

1.5.1 模板制備

挑取單一菌落于50 μL 無菌去離子水中，100℃水浴5 min，12 000 r·min-1離心20 min，取上清作為PCR 反應的模板。

1.5.2 PCR 擴增和測序

采用細菌16S rDNA 通用引物(正向引物為27F:5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；反向引物為1492R:5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)，對菌株TZ-01 的16S rDNA 片段進行擴增。PCR擴增條件為：94℃預變性10 min；94℃變性40 s，55℃復性30 s，72℃延伸90 s，35 個循環；最后72℃延伸10 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，交由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

1.5.3 序列分析及系統發育樹構建

將測序得到的病原菌16S rDNA 序列，在GenBank 數據庫中進行DNA 序列的Blast 比對。下載已發表的相關弧菌屬細菌的16S rDNA 序列，利用MEGA7 軟件[15]進行序列比對和系統發育樹構建分析。采用鄰接法(Neighbor-Joining method，NJ)，選取P-distance 模型，進行系統發育樹構建。通過自展分析(bootstrapping)進行系統發育樹分支可信度檢驗，自展數據集設定為5 000 次。

1.6 藥敏試驗

將培養24 h 的細菌制備成1×108CFU·mL-1菌懸液，取50 μL 均勻涂布于TSA 培養基平板上，用無菌鑷子將抗生素紙片(杭州微生物試劑有限公司)貼于平板中央，每個平板1 片，28℃恒溫培養24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑(Ф)＞16 mm 判為高度敏感(用“+++”表示)；10 mm＜Ф≤15 mm 判為中度敏感(用“++”表示)；7 mm＜Ф≤10 mm 判為低度敏感(用“+”表示)；Ф≤7 mm 判為耐藥(用“-”表示)。

1.7 主要器官的組織病理觀察

采集自然發病中華烏塘鱧的肝臟和脾臟，用4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(H.E.)染色，中性樹膠封片，用尼康(Nikon)90i 顯微鏡進行觀察、拍照。

2 結果

2.1 癥狀

患病中華烏塘鱧主要表現為：游動緩慢、攝食能力下降，經常浮出水面并散布在養殖池周圍；體表出現出血斑點，魚鰭基部充血、背部肌肉潰爛等；解剖發現病魚肝臟病變呈土黃色，脾臟充血腫大，腸道后端有黃色粘液。

2.2 病原菌

從患病中華烏塘鱧的體表潰瘍部位、肝臟、脾臟等內臟中分離到一株優勢菌株，命名為TZ-01。菌株TZ-01 在TSA 培養基上培養24 h，形成淡黃色圓形菌落，隆起，表面光滑濕潤(圖1A)；在TCBS 培養基上形成圓形菌落，微隆起，呈藍色或藍綠色(圖1B)。革蘭氏染色呈陰性(圖1C)，短桿狀。

圖1 菌株TZ-01 的菌落特征和革蘭氏染色Fig.1 Colonies characteristics and Gram stain of the Strain TZ-01

2.3 人工感染實驗

菌株TZ-01 人工感染后的中華烏塘鱧癥狀與自然發病的癥狀相似。高濃度菌懸液(1×109CFU·mL-1)注射感染1～2 d 后，中華烏塘鱧開始大量死亡，至第5 d 全部死亡，死亡率100%；中濃度菌懸液(1×107CFU·mL-1)注射感染3～4 d 后，開始出現死亡，至第14 d 共死亡4 尾，死亡率40%；低濃度菌懸液(1×105CFU·mL-1)注射感染后，出現活動、攝食減少等不良反應，但14 d 內無死亡。對照組未出現死亡個體。人工感染發病的中華烏塘鱧同樣出現體表充血、鰭條充血、肝脾腫大等癥狀。從人工感染發病死亡的中華烏塘鱧病灶部位分離到優勢菌株，經生理生化鑒定與TZ-01 菌相同，再次感染中華烏塘鱧后同樣出現與自然發病類似的癥狀。表明TZ-01 菌即為此次養殖中華烏塘鱧皮膚潰瘍病的病原菌。

2.4 生理生化鑒定結果

API-20E 系統鑒定結果如表1 所示。菌株TZ-01 的主要特性為：革蘭氏陰性菌，短桿狀，在TCBS 培養基上形成藍綠色圓形菌落；發酵型，氧化酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶為陽性，β-半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶、苯丙氨酸脫氨酶為陰性；檸檬酸鹽、尿素、VP 為陰性，不產H2S；明膠酶和吲哚為陽性；利用葡萄糖、甘露醇和阿拉伯糖產酸，不利用肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖和苦杏仁苷。根據上述結果，參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第八版)[16]及相關文獻[17-19]報道，判定菌株TZ-01 與副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus 的各項生理生化特征一致。

表1 菌株TZ-01的API-20E生化鑒定結果Tab.1 Results of biochemical identification of the strain TZ-01 by API-20E

2.5 16S rDNA 序列分析

利用通用引物27F 和1492R，從菌株TZ-01 的基因組DNA 中擴增得到長度約1 400 bp 的PCR 產物(圖2)，測序得到菌株TZ-01 的16S rDNA 序列長度為1 381 bp(GenBank 登錄號為MK341129)。在GenBank 數據庫中進行DNA 序列的Blast 比對發現，菌株TZ-01 與副溶血弧菌的16S rDNA 序列相似度最高，達到99%。從NCBI 數據庫選取10 種弧菌的16S rDNA 序列，利用MEGA 7 軟件構建Neighbor-Joining(NJ)系統發育樹。結果表明，菌株TZ-01 首先與副溶血弧菌發生聚類，置信度為97%(圖3)，說明菌株TZ-01 與副溶血弧菌的親緣關系最近。結合生理生化鑒定的結果，可以將菌株TZ-01 鑒定為副溶血弧菌。

圖2 菌株TZ-01 的16S rDNAPCR 產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products of the strain TZ-01

圖3 基于16S rDNA 序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

2.6 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果如表2 所示。在所試驗的20 種藥物中，菌株TZ-01 對米諾環素、多西環素、四環素、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢他啶和頭孢呋辛等7 種抗生素高度敏感；對頭孢拉定、哌拉西林、氨芐西林、苯唑西林和青霉素等5 種抗生素不敏感。

表2 藥敏試驗結果Tab.2 The results of the drugs sensitivity test

2.7 主要器官的組織病理觀察

經組織切片觀察發現，患病中華烏塘鱧的肝臟和脾臟器官均發生了不同程度的損傷。病魚肝組織嚴重變性壞死，肝細胞排列紊亂，細胞界限模糊不清；部分肝細胞解體，肝細胞肥大，呈現脂肪變性、空泡化(圖4A)。病魚脾臟組織同樣出現不同程度的變性壞死，脾竇和脾索不清晰，內有大量的含鐵血黃素沉積；部分脾臟細胞解體，細胞核溶解(圖4B)。

圖4 患病中華烏塘鱧病理組織切片Fig.4 Pathological sections of diseased Chinese black sleeper

3 討論

本研究從患皮膚潰瘍病的養殖中華烏塘鱧體表病灶及內臟分離到一株優勢菌TZ-01，經人工感染實驗證實該菌是引發養殖中華烏塘鱧皮膚潰瘍病的病原之一。綜合細菌形態觀察、生理生化特性測定以及系統發育分析的結果，鑒定菌株TZ-01 為副溶血弧菌。

弧菌廣泛分布于半咸水、河口、海洋的水體、沉積物中以及海洋生物的體表和腸道中，是海水、原生動物、魚類等海洋生物的正常優勢菌群[20]。由弧菌屬細菌感染引起的弧菌病，給海水養殖魚類、貝類及甲殼類等經濟動物的養殖業造成巨大的經濟損失[21]。其中，副溶血弧菌是引起多種海水魚類弧菌病的主要病原菌之一。據報道，副溶血弧菌可以感染包括大黃魚Larimichthys crocea[17]、石斑魚Epinephelus[22]、凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei[23-24]、貝類等[25]多種經濟水產養殖動物并引起大量死亡，從而造成嚴重的經濟損失。陳心等[26]從福建東山養殖場的患病中華烏塘鱧體內分離到了2 種病原菌(分別命名為090625 和070925)，經鑒定分別為哈維氏弧菌V.harveyi 和副溶血弧菌。該團隊利用褐菖鮋Sebastiscus marmoratus 和大黃魚分別開展回歸感染和攻毒實驗，結果表明這兩種病原菌均能感染上述2 種試驗魚并引起典型的弧菌感染癥狀[26]。這些研究結果表明，副溶血弧菌是引起養殖中華烏塘鱧弧菌感染的常見致病菌之一。

人工感染實驗發現，高濃度和中濃度的副溶血弧菌注射感染能引起中華烏塘鱧大量死亡，而低濃度注射感染雖會引起不良反應，但并未引起魚體死亡。該結果表明，副溶血弧菌感染并導致中華烏塘鱧死亡具有劑量依賴性的特點。作為條件致病菌，弧菌引起養殖水產動物發病通常與養殖環境中的弧菌數量有關[21]。當養殖環境惡化時，水體中正常的弧菌菌群發生大量繁殖，進而引起養殖水產動物爆發弧菌性疾病。目前中華烏塘鱧的養殖仍然依靠小雜魚、蝦等天然餌料[3]，餌料殘留、排泄物積累等容易引起養殖水體惡化，進而導致副溶血弧菌等條件致病菌大量繁殖。此外，中華烏塘鱧屬于兇猛的肉食性魚類，容易出現互相殘殺現象[3]，極易導致體表出現創傷，從而加劇養殖中華烏塘鱧通過體表傷口感染致病菌的幾率。因此，在中華烏塘鱧養殖過程中，應注意控制養殖密度、適時適量投喂餌料，避免水質敗壞，并及時進行分級培育。

自然發病和副溶血弧菌人工感染發病的中華烏塘鱧均表現出體表出血、肌肉潰爛等癥狀，這與大黃魚[17，26]、褐菖鮋[26]、大菱鲆Scophthalmus maximus[19]等魚類感染副溶血弧菌的癥狀相一致。組織病理學觀察發現，副溶血弧菌感染會嚴重損傷中華烏塘鱧的內臟器官。對感染副溶血弧菌的三斑鲹進行組織病理學觀察發現，病魚的腸道黏膜脫離、壞死，肝臟發生脂肪變性[27]。感染哈維氏弧菌后，大黃魚的頭腎、脾臟、肝臟等內臟器官均出現不同程度的變性以及壞死[28-29]。溶藻弧菌V.alginolyticus 感染同樣會對斜帶石斑魚E.coioides 的肝臟、腎臟等主要器官造成嚴重病理損傷[30]。肝臟和脾臟是重要的免疫器官，在硬骨魚類天然免疫中發揮重要的作用[31]。因此，由肝臟和脾臟嚴重壞死引起的魚體免疫力下降，以及內臟功能衰竭很有可能是造成感染副溶血弧菌中華烏塘鱧出現死亡的重要原因之一。

藥敏試驗表明，TZ-01 菌株對米諾環素、多西環素等7 種抗生素高度敏感；對頭孢拉定、哌拉西林、等5 種抗生素不敏感。對從患病大菱鲆體內分離到的副溶血弧菌開展藥敏試驗發現，該菌株對慶大霉素、紅霉素、鏈霉素和呋喃妥因敏感，但是對青霉素、環丙沙星和四環素不敏感[24]。對從患病凡納濱對蝦體內分離到的副溶血弧菌開展研究發現，該致病菌株對氧哌嗪青霉素高度敏感，但是對麥迪霉素、恩諾沙星、土霉素產生較強的抗藥性[32]。這些藥敏試驗研究的結果，可以為副溶血弧菌引起的水產動物疾病防治提供用藥參考。