響應面法優化牡蠣蛋白酶解工藝的研究

梁瑞萍，謝 超，梁 佳，何定芬，李海波

(1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316022；2.浙江國際海運職業技術學院，浙江舟山 316021)

牡蠣Crassostrea gigas Tnunberg，俗稱生蠔，屬于翼形亞綱牡蠣目。牡蠣作為一種重要的海洋生物，其藥用價值和營養價值非常豐富，主要營養和藥用成分是牛磺酸[1]、蛋白質、維生素[2]、DHA[3]、EPA[4]礦質元素鈣以及生物活性肽[5]等成分，能夠有效降血壓、抗氧化、抗腫瘤及提高免疫力等特殊功能[6]。舟山長牡蠣也是一種常見的牡蠣品種，具有生長快且環境適應性強的優點。

目前，有關長牡蠣活性物質的提取和研究工作逐漸展開，為牡蠣在營養和醫療保健方面提供了新的思路。牡蠣軟體部分不僅蛋白含量尤為豐富，還表現出低脂肪的營養特點，又因其結構齊全的氨基酸組成也成為人們瘋狂追捧的食物[7-8]。目前提取牡蠣蛋白的方法各種各樣，其中包括化學合成法、基因工程法、從一些動植物組織中直接提取法以及酶解法[9]等手段。酶水解法具有反應條件溫和而且實驗過程易于控制的特點，在蛋白的提取中被廣泛運用。利用酶法對蛋白質資源進行深加工，生產具有生物活性的多肽，是實現蛋白質高價值利用的重要途徑之一，酶法制備具有一定生理作用的牡蠣活性蛋白肽具有廣闊的市場發展前景[10]。

梁曉芳等[11]研究了不同種類扇貝通過多種酶的水解作用，發現中性蛋白酶水解效果最佳且得到具有強抗氧化活性的酶解產物；李婷菲等[12]研究毛蚶堿性蛋白酶水解肽，發現堿性蛋白酶能夠很好地酶解得到高價值的蛋白；馬銘研等[13]以厚殼貽貝多糖提取率為指標，通過酶解法提取出貽貝多糖，并設計響應面優化實驗方案得到最佳酶解工藝，此條件下的多糖組分能夠檢測到明顯的免疫力提高效果。本論文主要以酶添加量、pH、酶解溫度為變量因素，以牡蠣蛋白質的氨基態氮(AAN)為蛋白酶解程度指標，研究牡蠣軟體部分蛋白質酶解的方法，通過響應面優化設計酶解工藝條件，以期為合理開發，提高牡蠣高值化資源利用率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗原料及試劑

牡蠣：由浙江舟山常青海洋食品有限公司提供，牡蠣去殼洗凈泥沙后瀝干，得到干凈的牡蠣肉后用高速勻漿機搗碎均質待用。化學試劑酒精，冰醋酸，鹽酸，氫氧化鈉，甲醛等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。風味蛋白酶、木瓜蛋白酶，安琪酵母股份有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

NZ-100 高速均質機 上海愛朗儀器有限公司；HC-1016 高速離心機 日本日立公司；HH-4 恒溫水浴鍋常州市金壇友聯儀器研究所；電子天平；pH 計 上海精密儀器有限公司；IKA 磁力攪拌器 鄭州南北儀器設備有限公司。

2 實驗方法

2.1 原料預處理

將-18℃冷凍牡蠣取出解凍，取出軟體部分，將牡蠣的軟體部分清洗干凈，備用。

2.2 牡蠣蛋白的提取工藝

取一定量的牡蠣軟體部分，用高速均質機搗碎牡蠣肉，按照一定的液料比加入蒸餾水后開始均質勻漿，用稀鹽酸和氫氧化鈉調節牡蠣蛋白液的酸堿環境，加入適量的蛋白酶后放置于設定好的溫度條件下開始酶解，酶解相應的時間后開始滅酶，加熱溫度到90℃以上并維持10 min，待酶解液冷卻后5 000 r·min-1離心20 min 收集蛋白清液。

2.3 氨基態氮(AAN)含量測定

氨基態氮采用甲醛滴定法[14]。蛋白質水解成氨基酸，是氮元素以氨基酸形式存在的。多肽是氨基酸脫水縮和形成的聚合物，本質上是不是氨基酸，在甲醛滴定法中，甲醛是遮蔽劑，它能夠屏蔽氨基酸中的氨基，然后用NaOH 滴定測得羧基含量，根據氨基酸結構公式，即可得出氮元素的含量，多肽也會有游離羧基，因此氨基態氮指標代表酶解液中游離氨基酸和多肽的總和，可以反映牡蠣蛋白水解程度。

酶解前牡蠣肉為10 g，取5 mL 酶解上清液至250 mL 的燒杯中放入磁石，加入60 mL 蒸餾水稀釋并將燒杯置于磁力攪拌器上，調整合適的轉速值，用0.05 M 的Na0H 標準溶液滴定至8.2 記錄其體積數，第二步在加入濃度比為40 %的中性甲醛并混勻后，用0.05 mol·L-1的NaOH 標準溶液滴定，記錄到pH 為9.2 時的NaOH 體積數，記為V1。每組重復試驗3 次平行，并且要做空白對照試驗得到體積數V2。

氨基態氮的含量計算：

2.4 酶的選擇

牡蠣軟體部分酶解：取10 g 牡蠣肉，加一定量的蒸餾水，以氨基態氮(AAN)含量為評價蛋白質提取量的指標，篩選出以下5 種不同種類蛋白酶，分別是胰蛋白酶、中性性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶，對應酶分別在酶活力最適宜的溫度幾pH 條件下進行試驗(表1)。其他實驗因素分別設定為：酶添加量為0.8%，酶解時間4 h，開水煮沸滅酶10 min，5 000 r·min-1離心10 min，選擇酶解牡蠣蛋白最合適的蛋白酶。

表1 不同種類蛋白酶對牡蠣軟體部分的酶解效果Tab.1 The enzymatic hydrolysis effect of different kinds of proteases on oyster soft parts

2.5 單因素實驗

(1)酶添加量對AAN 含量的影響：取酶添加量為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0 %，其他酶解條件為pH 7，溫度55℃，時間5 h，考察牡蠣軟體部分氨基態氮(AAN)含量的變化情況選取適宜酶添加量。

(2)pH 對AAN 含量的影響：取pH 為5.5、6、6.5、7、7.5，此時實驗中還要設置不變量為：酶添加量1.6 %，酶解溫度55℃，酶解時間5 h，液料比1:1，考察牡蠣軟體部分AAN 含量的變化情況選取適宜酶解的pH。

(3)酶解溫度對AAN 含量的影響：取酶解溫度為45、50、55、60、65℃，其他酶解條件為液料比1:1，酶解液pH 7，酶解時間5 h，酶添加量1.6 %，考察牡蠣軟體部分AAN 含量的變化情況選取適宜酶解溫度。

(4)酶解時間對AAN 含量的影響：通過研究考慮設置單一變量4、4.5、5、5.5、6 h 進行不同條件的酶解，此時實驗中還要設置不變量為酶添加量1.6 %，酶解液的pH 7，酶解溫度55℃，液料比1:1，測定牡蠣軟體部分AAN 含量的變化情況選取適宜酶解時間。

(5)選取去離子水和牡蠣肉的含量比分別是1:1、2:1、3:1、4:1、5:1，此時實驗中還要設置不變量為酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，酶解pH 為7，添加酶量1.6 %，考察牡蠣軟體部分AAN 含量的變化情況選取適宜酶解液固比。

2.6 響應面優化實驗

選擇風味蛋白酶作為最佳的酶制劑。根據單因素實驗結果，選取酶添加量(A)、pH (B)和酶解時間(C)3個因素為實驗變量，實驗將對這三因素的最佳條件進行探索和優化(表2)。

表2 牡蠣酶解條件三因素水平表Tab.2 Table of three factors of oyster enzymatic hydrolysis conditions

2.7 數據處理

實驗所得數據通過origin 9.0 進行處理，用Design-Expert11分析進行顯著性分析。檢測各組分之間的差異，顯著性水平設定P＜0.05。

3 討論

3.1 酶制劑的選擇

不同蛋白酶對氨基態氮(AAN)含量的影響如圖1 所示。不加酶的空白組經一系列處理后測得的氨基態氮是1.61 mg·g-1，其余5 種不同蛋白酶處理實驗結果顯示，蛋白酶的添加可以使蛋白質的水解效果改善。其中牡蠣蛋白酶解作用最強的是風味蛋白酶，測得氨基態氮含量5.21 mg·g-1，其次是中性蛋白酶，酶解后氨基態氮含量5.18 mg·g-1，另外3 種蛋白酶酶解后氨基態氮含量都高于空白組測得的氨基態氮含量。綜上選取風味蛋白酶作為實驗酶來酶解牡蠣軟體部分，從而提取牡蠣蛋白。

3.2 酶添加量對氨基態氮(AAN)含量的影響

酶添加量對牡蠣軟體部分氨基態氮(AAN)含量的影響如圖2所示。由圖2 可知，風味蛋白酶能夠很大程度上促進牡蠣蛋白進行酶解，且氨基酸氮(AAN)含量先升高后降低，且上升的趨勢明顯高于下降的趨勢。當風味蛋白酶添加量為1.2 %時，牡蠣軟體部分測得的氨基態氮含量達到最大值7.64 mg·g-1。蛋白酶往往只有與蛋白質充分接觸時，才能發揮作用，一旦酶與底物的作用開始達到飽和狀態時，過度酶解導致部分小分子物質與蛋白又發生乳化，產生絮狀類物質，使氨基態氮(AAN)含量降低[15]。綜合實際生產加工經濟因素，酶解牡蠣軟體部分時，酶添加量為2.0%。

3.3 酶解pH 對氨基態氮(AAN)含量的影響

由圖3 可知，酶解pH 值對牡蠣軟體部分AAN 含量的影響結果。隨著pH 值的提升，AAN 含量先增加后下降，當pH 達到6.5時，牡蠣軟體部分氨基態氮含量達到最大值5.74 mg·g-1，牡蠣蛋白在偏中性時風味蛋白酶活性達到最佳作用效果，此時牡蠣蛋白的酶解程度最好。故牡蠣軟體部分經風味蛋白酶酶解作用時最適pH 為8.5。

3.4 酶解溫度對氨基態氮(AAN)含量的影響

圖1 不同種類蛋白酶水解度的比較Fig.1 Comparison of hydrolysis degree of different proteases

圖2 不同酶添加量對氨基態氮(AAN)含量的影響Fig.2 Effects of different enzyme additions on amino nitrogen (AAN) content

圖3 酶解pH 對氨基態氮(AAN)含量的影響Fig.3 Influence of pH value of enzymatic hydrolysis on the content of amino nitrogen(AAN)

由圖4 可知，不同酶解溫度對牡蠣軟體部分AAN 含量的影響。AAN 含量隨著溫度的上升先增大后減小，原因是蛋白酶生理活性在最適溫度55℃時達到最高時，測得牡蠣蛋白酶解液中氨基態氮含量為5.33 mg·g-1，溫度對酶活性的影響較明顯。所以，較適宜的酶解牡蠣軟體部分的溫度為55℃。

3.5 酶解時間對氨基態氮(AAN)含量的影響

由圖5 可知，酶解時間對牡蠣軟體部分AAN 含量的影響較大。蠣軟體部分酶解液中氨基態氮的含量隨時間增加而增多，酶解時間5.5 h 時，牡蠣酶解液中氨基態氮含量為5.63 mg·g-1。5.5 h 后，牡蠣酶解液中氨基態氮含量與酶解時間的作用程度明顯降低，并且隨時間延長牡蠣酶解液顏色發生變化，逐漸變深。因此，風味蛋白酶酶解牡蠣蛋白最好時間控制在5.5 h。

3.6 液料比對氨基態氮(AAN)含量的影響

牡蠣軟體部分AAN 含量與液料比的關系如圖6 所示。液料比小于2 :1 時，加入蒸餾水越多，酶解效果越好；液料比為2 :1 時，酶解液中氨基態氮含量為5.58 mg·g-1；當液料比大于2 :1 后，水解程度逐漸減小，原因是當酶解液中水量增加，過多的牡蠣蛋白底物聚集于風味蛋白酶的結合位點，影響產物分子的擴散從而減緩酶解速度，而當蒸餾水逐漸變多時，酶解液中風味蛋白酶的濃度也隨之降低，酶解效果隨之減弱[16]。因此，風味蛋白酶酶解牡蠣肉選擇最佳液料比為1:1。

圖4 不同酶解溫度對氨基態氮(AAN)含量的影響Fig.4 Effects of different enzymatic hydrolysis temperatures on the content of amino nitrogen (AAN)

圖5 不同酶解時間對氨基態氮(AAN)含量的影響Fig.5 Effects of different enzymatic hydrolysis time on the content of amino nitrogen (AAN)

圖6 不同液料比對氨基態氮(AAN)含量的影響Fig.6 Influence of different liquid/material ratios on the content of amino nitrogen (AAN)

3.7 響應面優化實驗

根據表2 的設計對酶添加量(A)、pH(B)和酶解溫度(C)這3 個實驗變量進行3 因素3 水平的牡蠣蛋白酶解響應面優化實驗，以牡蠣軟體部分酶解液中AAN 含量為考察指標，所得實驗結果如表3。

表3 酶解反應響應面實驗分析及結果Tab.3 Response surface analysis and results of enzymatic hydrolysis reaction

通過Design-expert 11 軟件可得回歸方程方差分析表4，響應面實驗分析所得AAN 對酶添加量(A)，pH(B)和酶解溫度(C)的多元二次回歸方程為：

Y=-132.289 63+44.319 58 A+33.575 38 B+1.891 34 C+0.380 150 AB-0.647 192 AC+1.141 29 BC-17.706 59 A2-3.116 43 B2-0.841 967 C2。

由表4 中F 值可以看出，在酶添加量，pH 和酶解溫度這3 個因素中，pH 對酶解液中AAN 含量的影響最大，其次為酶添加量和酶解時間。同時，由上表可以看出，模型P 值為0.003 4，極顯著(P＜0.01)；失擬項P=0.348 0，不顯著(P＞0.05)，說明該模型為回歸顯著型，相關系數為0.925 4，說明擬合性高，實驗設計相對來說時可靠的。根據P 值可以看出，pH 對牡蠣蛋白酶解作用顯著(P＜0.05)，3 個影響因子對AAN 含量影響的排序：pH＞酶添加量＞酶解時間，其中A2、B2、C2的作用極顯著(P＜0.01)，BC 的作用具有顯著性(P＜0.05)。因此，使該用回歸方程表示牡蠣蛋白酶解液氨基態氮含量的分析和預測是可以參考的。

表4 數據回歸分析結果Tab.4 Data regression analysis results

另外，圖響應面值對各因素之間關系構成的平面圖和三維曲面圖，能很好的分析出各因素之間的相互影響以及得出實驗設計的最佳參數。

圖7 表示酶解時間為定量因素時，酶添加量和酶解pH 共同作用對酶解液中氨基態氮(AAN)含量影響變化的趨勢。由等高線圖7(A)和響應曲面圖7(a)可知，等高線隨酶解pH 的增大而變化的曲線密集程度大于等高線隨酶添加量增大而變化的曲線密集度，所以可以看出此時酶添加量和酶解pH 交互作用中，酶添加量的影響稍大于酶解pH。

圖7 酶添加量和pH 的平面圖和三維曲面圖Fig.7 Planar and three-dimensional graphs of enzyme addition and pH

對比圖8 (B) 可知，酶解時間對應的等高線密集程度大于酶添加量的等高線密集程度，由圖8(b)可知，二者同時的對牡蠣酶解液氨基態氮含量的影響較大。

圖8 酶添加量和酶解時間的響平面圖和三維曲面圖Fig.8 Planar and three-dimensional graphs of enzyme addition and enzymatic hydrolysis time

圖9 為不考慮酶解添加量對牡蠣蛋白酶解效果影響，2 種變量因素酶解時間和pH 對牡蠣酶解液中氨基態氮(AAN)含量的影響直觀圖如響應面圖9(C)和等高線圖9(c)。當酶解時間確定時，氨基態氮(AAN)含量隨pH 的增大而提高；當達到一定值時，氨基態氮(AAN)含量又會隨酶解時間的增大而降低。而pH 一定時，氨基態氮(AAN)含量隨酶解時間的增加，先減少后增加，達一定值時又出現減少的趨勢。綜上可看出，二者之間的交互作用明顯。

圖9 pH 和酶解時間的平面圖和三維曲面圖Fig.9 pH and enzymatic hydrolysis time of the planar and three-dimensional surface diagram

3.8 最佳提取條件預測及驗證

經響應面優化后，得到最優參數為酶添加量1.33%，pH 為6.919，酶解時間為4.763 h，此時牡蠣酶解液中AAN 含量的理論值為5.416 mg·g-1。考慮到實際生產要操作方便，確定AAN 含量的最佳工藝參數指標為：酶添加量1.3%、酶解液的pH7、酶解時間5 h，測定實際牡蠣酶解液的氨基態氮含量值以驗證響應面試驗的可行性。進行3 次試驗，結果測得AAN 含量的平均值為5.59±0.25 mg·g-1，基本符合響應面優化方案中的理論值。綜上，此蛋白酶解響應面優化實驗中得到的最佳工藝參數具有良好的可行性。

4 結論

本研究以牡蠣蛋白為研究對象，用不同種類蛋白酶對牡蠣軟體部分中蛋白進行生物酶法提取。研究結果表明，風味蛋白酶提取牡蠣蛋白的效果最好，氨基態氮含量達到5.21 mg·g-1。通過響應面法對風味蛋白酶酶解參數進行優化實驗，得出牡蠣蛋白經預處理后：酶添加量1.3%、pH 7、酶解時間5 h 的條件下氨基態氮(AAN)含量達到最高5.59±0.25 mg·g-1。牡蠣酶解物中氨基態氮含量能夠反應牡蠣蛋白的酶解程度，其酶解程度一般呈現先增后減的趨勢，是由于隨著酶解程度的加劇，牡蠣蛋白多肽被分解成氨基態氮化合物以及游離氨基酸，導致產物有所變化。因此，若要提取出具有特殊活性的牡蠣蛋白多肽要適當控制合適的酶解程度，進一步優化酶解條件。該研究結果將為牡蠣蛋白酶解工藝帶來一定的指導意義。