響應面法優化蓮花總黃酮超聲輔助提取工藝及其抗氧化性的研究

賀文韜，林 林，陳雨涔，陳 浩，鄧尚貴

(1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316022；2.舟山市農林科學研究院，浙江舟山 316000；3.舟山市普陀農林局，浙江舟山 316100)

蓮花Nymphaea hybrid 屬睡蓮科Nymphaeaceae、睡蓮屬Nymphaea 多年生宿根水生植物，為大型睡蓮。其香味淡雅高貴，花期長，在餐飲、醫療、凈化和修復環境等方面都有廣泛的應用，具有很大的經濟價值、生態價值和觀賞價值。蓮花中含有豐富的植物胎盤素、黃酮、粗多糖、生物堿、低聚糖等活性成分[1]，其醇提物具有降血脂[2]、美白[3-4]、抑制前列腺增生[5]、保護急性酒精肝損傷[6]等功效。蓮花中所含黃酮類化合物具有消炎、抗菌及抗氧化作用[7-11]。任紅榮等[12]研究了微波法提取蓮花中總黃酮工藝，黃酮得率為2.065%較低。本研究旨在通過響應面法優化蓮花總黃酮超聲輔助的提取工藝，得到較高的提取率，為進一步開發利用蓮花提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

蓮花樣品由舟山市農林科學院提供，產地浙江舟山。2018年8月采摘，剝去葉片，貼近花托基部切去花梗，鼓風真空干燥，粉碎后裝袋貯藏備用。蘆丁為標準品，BHT 為標準氧化劑，其它試劑均為分析純。高速多功能粉碎機、紫外分光光度計、超聲波清洗儀、高速冷凍離心機、水循環真空泵。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆丁標準工作曲線繪制

準確移取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 蘆丁儲備標準液(0.020 00 g·mL-1)于10 mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.2 mL 搖勻，靜置6 min，再加入10% AlCl3溶液0.2 mL，6 min 后加入4% NaOH 溶液2 mL，混合均勻后用無水乙醇定容至10 mL，顯色后用1 cm 的比色皿在波長410 nm 處(以不加蘆丁為試劑空白)測定吸光度，然后以吸光度為縱坐標，以濃度為橫坐標繪制標準工作曲線，得吸光度A 與蘆丁濃度C 的直線方程為A=15.05 C+0.02，相關系數為r=0.999 2。

1.2.2 蓮花中總黃酮的提取與含量測定

準確稱取1 g 蓮花干燥粉末，加入30 mL 70%乙醇溶液，70℃水浴超聲恒溫回流50 min，抽濾，濾液經11 000 r·min-1高速離心過濾，得蓮花總黃酮離心液。離心液用浸提的乙醇溶液定容至50 mL，得樣品溶液。按試驗方法1.2.1 顯色并測定其樣品中總黃酮的含量。然后按下式計算樣品中總黃酮的提取率。

1.2.3 單因素實驗

改變提取條件，考察不同的料液比、乙醇體積分數、提取時間、浸提溫度對總黃酮提取率的影響。

1.2.4 響應面法優化蓮花總黃酮提取工藝

在單因素實驗結果的基礎上，確定料液比、乙醇體積分數、提取時間3 個影響較為顯著的因素，在固定提取溫度為70℃、提取次數為2 次的實驗條件下進行3 因素3 水平Box-Behnen 響應面優化實驗。響應面法實驗設計因素和水平如表1。

表1 響應面設計因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 抗氧化性實驗

抗氧化性實驗參考陳境等[13]的方法進行。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

圖1 表示乙醇體積分數對蓮花總黃酮提取率的影響。從圖1 可以看出，在物料比為1：30，70℃水浴恒溫提取30 min 的實驗條件下，乙醇體積分數對蓮花黃酮提取率有較大影響。當乙醇體積分數為70%時，黃酮提取率為最高13.99%，小于70%時黃酮提取率隨乙醇體積分數的增加而大幅度增加，大于70%時黃酮提取率增加不明顯，而80%時提取率反而下降，綜合考慮選提取蓮花總黃酮的最佳乙醇體積分數在70%。

圖2 表示不同的溫度對蓮花黃酮提取率的影響。圖2 顯示溫度在40～65℃內，提取率隨溫度的升高而大幅度增大，65～80℃區間內趨于平緩，70℃時達到最大。隨著溫度的升高，分子運動加快，有利于黃酮的浸出。但溫度過高乙醇會蒸發，黃酮結構也會被破壞。故選擇70℃為最佳浸提溫度。

圖1 乙醇體積分數對提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume concentration on extraction rate

圖2 溫度對蓮花黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of flavonoids from lotus

固定物料比為1∶30，乙醇體積分數為70%，在70℃水浴恒溫超聲回流提取10、30、60、90、120 min，其蓮花黃酮提取率隨時間變化的情況如圖3 所示。從圖3 可以發現，隨著時間的增長，提取率呈現先增大后減小的顯著遞進規律，提取率曲線在10～30 min 顯著提升，最大值達到13.16%，在30～120 min 時蓮花黃酮的提取率呈下降趨勢，最低值為9.04%，提取時間過長提取率下降的主要原因可能是因為隨著提取時間的增長，蓮花中提取的黃酮可能隨著溶劑乙醇被蒸發，導致提取率下降。

按實驗方法1.2.3 固定乙醇體積分數為70%，水浴溫度70℃、超聲回流提取時間30 min，將各處理組的物料比變量分別定為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 時，測定各組提取率數據并繪制圖4，觀察圖4 可知，將蓮花粉末物質的量定為1 g，隨著溶劑體積的不斷增大，提取率一直增大，至溶劑為30 mL 左右時黃酮的提取率基本保持不變，當溶劑體積在30～35 mL 時提取率呈現小幅度的下降。可能的原因是，在一定的物料比范圍內，黃酮類物質的溶出速度隨著物料比的增加而增大，物料比達到1∶30 以后，黃酮類物質的溶解度和溶出速度達到最大，因此再增加溶劑的量也不會增加其提取率。

圖3 時間對提取率的影響Fig.3 Effect of time on extraction rate

圖4 物料比對蓮花黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of material ratio on extraction rate of flavonoids from lotus

2.2 響應面法實驗結果與分析

2.2.1 響應面法實驗設計與結果

通過單因素實驗，選取時間、物料比、乙醇體積分數3 個因素3 個水平的Box-Benhnken 模型進行優化實驗，實驗設計及結果如表2。

表2 蓮花總黃酮提取工藝的響應面實驗設計及結果Tab.2 Response surface design with results for extraction of total flavonoids from Lotus

2.2.2 提取工藝條件的響應曲面分析

圖5 顯示的是多因素交互作用分析結果。從圖5 可以看出，乙醇體積分數(A)與物料比(B)、物料比(B)與提取時間(C)之間的相互作用對蓮花黃酮提取率的影響較為顯著，而乙醇體積分數(A)與提取時間(C)之間的相互作用對蓮花黃酮提取率的影響不明顯。

圖5 乙醇體積分數與料液比、乙醇體積分數與時間和料液比與時間對黃酮提取率的交互作用Fig.5 Interaction of ethanol volume fraction with material-liquid ratio，ethanol volume fraction with time and material-liquid ratio with time on flavonoid extraction rate

2.2.3 響應面回歸模型的方差分析

利用Design expert 8.0 軟件對表2 試驗數據進行方差分析和多元回歸擬合方程為Y=13.9+0.9 A+0.042 B+1.03 C+0.17 AB+1.59 AC+0.88 BC-1.16 A2-1.62 B2-3.29 C2回歸方程模型方差分析如表3。由表3可知回歸模型P＜0.000 1，極顯著，失擬項P=0.102 1＞0.05，影響不顯著，表明二次回歸模型與實際情況擬合較好。R2=0.997 5，表示模型顯著，對回歸方程中3 個因素分別求導，并另一階偏導方程等式為0，得出三元一次方程組，解得A、B、C 分別為A=0.619、B=0.134、C=0.324，轉換之后可得最優的組合解是乙醇體積分數為70%、物料比為1 :30、時間為29 min，通過回歸方程計算，理論上的最大提取率為13.92%。

由表3 可知體積分數、物料比和時間3 個變量因素相互影響互為顯著，并對影響蓮花黃酮提取率的單因素進行效益排序可得時間＞體積分數＞物料比。

表3 蓮花總黃酮提取工藝條件響應曲面回歸方程的方差分析Tab.3 Anova of regression equation of response surface for extraction condition of total flavonoids from lotus flower

2.2.4 驗證實驗

按優化所得的最佳提取工藝進行驗證性實驗，即采用1 g 蓮花干燥粉末，加入30 mL 的70%的乙醇溶液，在70℃下超聲水浴回流提取時間29 min 浸提2 次，合并濾液，旋轉蒸發得膏狀固體，經冷凍干燥后稱量，平行5 次實驗，得黃酮平均提取率為14.07%。與模型預測值之間相差0.150 0%，重復性較好。

2.2.5 抗氧化性研究結果

由圖6 可知，在測定的濃度范圍內，蓮花總黃酮和BHT 的還原能力隨濃度的增加而逐漸增強。當濃度小于0.05 mg·g-1時，蓮花總黃酮的抗氧化性略小于BHT；當濃度大于0.05 mg·g-1時，蓮花總黃酮明顯大于BHT。

圖6 蓮花總黃酮和BHT 還原Fe3+能力Fig.6 The ability of lotus flaconoids and BHT to reduce Fe3+

3 結論

(1)采用響應面法優化了超聲協助乙醇回流提取蓮花總黃酮工藝條件，得最佳工藝實驗條件為：乙醇體積分數為70%、物料比為1:30、時間為29 min，在此實驗條件下提取二次，總黃酮的提取率為14.07%。驗證實驗結果顯示此提取工藝可行性強，重復性好，所用的溶劑可以回收利用，可降低成本，且不會污染環境，能為蓮花的綜合開發利用提供理論基礎。

(2)抗氧化性實驗表明，蓮花總黃酮還原Fe3+的能力隨著其質量濃度的增大而增大，相比BHT，低濃度時比BHT 略低，高濃度時比BHT 強。可見，蓮花抗氧化性較好，具有較好的開發價值。