PI3K信號通路激活對PCOS大鼠生殖相關內分泌指標的影響

李 曼，劉春麗，毛紅梅，徐淑琴

多囊卵巢（PCOS）屬內分泌紊亂綜合征，臨床多伴隨卵巢多囊樣改變、稀發排卵或不排卵、胰島素抵抗（IR）等癥狀[1]。其發病機制尚未完全明確，多認為IR參與其發病過程[2]。PI3K途徑是與細胞內糖代謝密切相關的信號通路，PI3K信號磷酸化減少為PCOS出現IR的重要特征。動物實驗證實，利拉魯肽可通過降低PI3K抑制劑對PI3K通路的抑制影響，發揮神經細胞保護作用[3]。但目前對利拉魯肽對PCOS的治療作用了解尚少，對其確切作用機制及對PI3K通路的影響尚未完全明確。基于此，本研究建立PCOS大鼠模型，并給予利拉魯肽干預，旨在研究利拉魯肽對PI3K信號通路的影響及其調節PCOS大鼠生殖內分泌的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由湖北省實驗動物研究中心提供的清潔級SD雌性大鼠[SCXK(鄂)2013-0016]，體質量190～210 g，自由攝食、水，自然光照，室溫 23 ℃，光照周期12 h明/12 h暗，適應性喂養1 w。

1.2 主要試劑與儀器 利拉魯肽注射液（丹麥Novo Nordisk A/S 公司），DHEA（美國 IL 公司）；Western blot試劑盒（Fermentas公司），RT-PCR 試劑盒（ToYoBo公司），Trizol試劑盒、cDNA 逆轉錄試劑盒，P、T、E2酶聯免疫試劑盒（Invitrogen公司）；Light Cycler480型RT-PCR儀，Imark全自動酶標儀（基因有限公司）。

1.3 分組、建模及給藥方法 將30只SD健康雌性大鼠隨機分為參照組、模型組與干預組，各10只。除參照組外，均采用DHEA法建立PCOS大鼠模型[6]：每日自大鼠頸背部皮下注射DHEA 600 mg/100 g，連續21 d，見大鼠體重增加，陰道涂片動情周期消失，血清雄激素、黃體生成素升高，卵巢體積增大，卵巢組織呈多囊樣改變，為造模成功[7]。干預組在造模成功后，自頸背部皮下注射利拉魯肽0.4 mg/kg，1次/d；參照組和模型組注射同等量生理鹽水，兩組均持續給藥16 w。期間所有大鼠正常攝食飲水。

1.4 標本采集 干預結束后，各組均空腹10 h，次日清晨采用10%水合氯醛麻醉大鼠，快速心臟取血，離心后低溫冷藏備用；取雙側卵巢組織，右側卵巢采用多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度連續切片，行HE染色及免疫組化觀察；左側卵巢組織用無菌生理鹽水沖洗，冷凍儲存，備用。

1.5 檢測指標

1.5.1 卵巢組織形態學 對卵巢組織切片后進行染色，鏡下觀察卵巢組織形態變化。

1.5.2 激素和血糖 以酶聯免疫法測定大鼠血清孕激素（P）、睪酮（T）水平，以氧化酶法測定空腹血糖（FPG）水平。

1.5.3 卵巢組織PI3K mRNA 提取大鼠卵巢組織總RNA，進行純度、濃度鑒定，逆轉錄制備cDNA，采用RT-PCR法測定卵巢組織PI3K mRNA水平。

1.5.4 卵巢組織PI3K信號通路各分子蛋白表達水平 以Western blot法測定卵巢組織PI3K信號通路相關分子AKT、p-AKT蛋白表達水平。取冰凍卵巢組織，解凍研磨，充分裂解，12 000 r/min離心10 min，獲取蛋白提取液；加蛋白上樣液，凝膠電泳、轉膜，脫脂奶粉封閉；加一抗孵育過夜，洗膜，加過氧化物標記二抗，孵育60 min，洗膜3次×5 min，X光片顯影，計算機攝像，采用全自動凝膠成像系統分析條帶，以目的條帶、內參條帶光密度比值為蛋白表達量。

1.6 統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件分析，計量資料以±s表示，多組比較行方差分析，組內比較進行LSD-t檢驗；計數資料以頻數和百分率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠卵巢組織形態觀察 參照組卵巢組織切片HE染色見不同發育階段卵泡，見多個黃體，顆粒細胞層約為8～9層，且細胞形態完整，排列整齊、緊密，卵泡膜細胞層薄，為1～2層（圖1a）；模型組卵巢結構紊亂，近包膜下見多個囊性擴張卵泡，部分卵泡內無卵母細胞，且放射冠消失，可見顆粒細胞層數減少，少見黃體（圖1b）；干預組顆粒細胞層較模型組增多，卵泡膜細胞層變薄，見成熟卵泡，黃體數量較模型組多（圖1c）。

2.2 各組激素和血糖水平比較 參照組與干預組血清P和FPG水平比較無顯著差異，且均與模型組比較有顯著差異（P＜0.05）；3組血清T水平大小順序為參照組＜干預組＜模型組（P＜0.05，表1）。

表1 各組激素和血糖水平比較（n=10）

圖1 各組卵巢組織形態結構（HE×100）

2.3 各組卵巢組織PI3K mRNA水平比較 模型組PI3K mRNA、AKT蛋白、p-AKT蛋白表達水平低于參照組與干預組（P＜0.05）；干預組僅PI3K mRNA表達水平高于參照組 （P＜0.05），而AKT蛋白和p-AKT蛋白表達水平與參照組相近（P＞0.05）。見表2。

表2 各組卵巢組織Pl3KmRNA表達和AKT及p-AKT蛋白表達水平比較（n=10）

3 討論

PCOS患者不僅生殖功能異常，且伴有糖耐量降低、糖脂代謝異常等內分泌代謝紊亂表現，遠期易出現IR、糖尿病及心血管疾病[4]。研究認為，PCOS患者普遍存在選擇性IR，主要體現在胰島素信號轉導異常、信號通路代謝途徑缺陷等[5]。

PI3K是具備特異性催化磷脂酰肌醇脂物質的激酶類型，有脂類激酶及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，可被絡氨酸與非絡氨酸激酶受體等細胞因子受體活化[6]。PI3K信號通路是與細胞內糖代謝調節緊密關聯的信號途徑，而PI3K途徑磷酸化減少則為PCOS胰島素抵抗的主要表現，可直接導致信號通路中斷，引起與染色體遺傳物質變異相關疾病，直接影響人體生理功能及發育進程[7]。本研究采用DHEA法建立PCOS大鼠模型，結果發現，與參照組比較，PCOS模型組卵巢組織PI3K mRNA表達水平明顯降低，且與PI3K信號通路相關蛋白p-AKT表達水平也降低，表明PCOS大鼠存在明顯胰島素PI3K信號通路異常表現。

本研究還發現，模型組P水平較參照組更低，而T、FPG水平較參照組更高，證實PI3K信號通路異常與PCOS卵巢激素合成存在密切聯系，該通路信號磷酸化異常是導致PCOS并發高雄激素血癥的重要原因，且PCOS胰島素抵抗與高雄激素血癥形成惡性循環，進一步影響其卵巢功能[8]。因此，必須重視改善其IR，實現促排卵。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）則為進食后遠端腸腔L型細胞所分泌的腸促胰素，其與GLP-1受體結合后可降低胰高糖素分泌，刺激迷走神經，控制食欲及飽腹感，延遲胃排空，降低體重，早期被證實在2型糖尿病（T2DM）治療中有肯定的效果[9]。利拉魯肽則為臨床常用GLP-1類似物，可有效降低T2DM患者FPG、餐后2 h血糖及糖化血紅蛋白，同時改善患者胰島β細胞功能，且減重效果明顯。

本研究還發現，干預組顆粒細胞層增多，成熟卵泡、黃體數量較模型組多，考慮是因為利拉魯肽干預可通過激活PI3K通路，調節甾體激素合成酶表達，降低卵巢顆粒細胞睪酮合成能力，抑制高雄激素血癥，上調孕激素表達，促進卵泡發育，同時抑制胰島β細胞凋亡，改善胰島細胞功能，糾正PCOS胰島素抵抗及糖代謝紊亂[10]。

綜上所述，利拉魯肽可通過激活PI3K信號通路，調節甾體激素合成酶表達，抑制雄激素表達，改善PCOS胰島素抵抗，調節其糖代謝，促進卵泡發育。