氨基酸紙色譜層析法實驗條件優化的探索

劉穎沙， 劉小寧， 李國秀， 劉 偉， 時 靜， 孫 進， 鐘 陽

(楊凌職業技術學院， 陜西 楊凌 712100)

紙色譜法是以濾紙為支持物的層析技術，濾紙纖維上分布大量的親水性羥基，因此與水親和力強，與有機溶劑親和力弱，所以在展層時，水是固定相，有機溶劑是流動相，由于溶質在兩相中分配系數不同，不同的氨基酸隨流動相移動的速率就不同，于是將這些氨基酸分離開來，形成距原點距離不同的色譜點，各物質分配系數相差越大，則越容易分開。樣品被分離后在紙色譜圖譜上的位置，常用比移值Rf(Rf=原點到色譜點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離)表示，在一定條件下(如溫度、展開劑的組成、色譜紙質量等不變)，某物質的Rf是定值，可作為定性分析的依據。紙色譜分離技術廣泛應用于氨基酸、蛋白質、染料、色素和中草藥等物質的分離和鑒定，其操作簡便，樣品用量小，既可以用作實驗室的定性分離，也可用于工業生產產品的分析制備，現已成為生物化學和生物工程等學科必不可少的分析工具之一。在農產品質量檢測專業的《食品生物化學》課程中“氨基酸的紙色譜”是學生重要的實驗實訓內容[1]，但是如果按照課本步驟操作：首先，耗時過長，無法在4學時內完成實驗；其次，用微量注射器或者毛細管進行點樣的方式受人為因素干擾，組間結果差異較大；第三，濾紙易受污染，用濾紙作為惰性支持物容易影響最后分離效果；第四，展開劑展開速度較慢且有刺激性氣味；第五，用噴霧器噴顯色劑(茚三酮溶液)，噴出量和均勻性無法把握，容易污染學生的實訓服。為改善實驗方法，本文對“氨基酸的紙色譜”實驗的固定相、展開劑、點樣方式和顯色方式進行優化[2-6]。

1 材料與方法

1.1 材料

色譜濾紙(新華一號濾紙)、薄層板、剪刀、層析缸(燒杯500 mL)、培養皿、吹風機、微量注射器(5 uL)或毛細管、移液槍(5uL)、噴霧器、尺子和鉛筆、鑷子、封口膜。

1.2 試劑

(1)0.5%的氨基酸溶液(亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、纈氨酸)，各種試劑均為分析純。

(2)展開劑(100 mL)。

1號：V(正丁醇)：V(冰醋酸)=4∶1；

2號：V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2；

3號：V(正丁醇)：V(冰醋酸)：V(乙醇)：V(水)=4∶1∶1∶2；

4號：V(95%乙醇)：V(水)=7∶3。

1.3 顯色方式

傳統方法，展開完成之后用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮溶液進行顯色；改進方法,100 mg茚三酮加入配置好的展開劑。

2 實驗步驟

2.1 點樣方式與展開劑的優化[7，8]

(1)濾紙。取濾紙1張(22×14 cm)。

(2)點樣。距一端2 cm處用鉛筆輕輕的劃線，然后在線上分別用0.5%的亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸和纈氨酸均勻點樣(微量注射器5uL、毛細管、移液槍5 uL)，重復3次，每次點樣完后用吹風機冷風吹干，每點擴散直徑不超過5 mm。將點好樣的濾紙卷成筒狀，使用大頭針縫好(按課本操作步驟用針線縫，常常扯爛濾紙，影響實驗結果)。

(3)展開[9]。將盛有20 mL展開劑的培養皿迅速置于500 mL的燒杯中，并將點樣筒直立于培養皿中(點樣端在下)，用封口膜封緊燒杯口，待溶液上升至15～18 cm時，取出濾紙，用鉛筆畫出溶劑前沿界線，吹風機冷風吹干。

(4)顯色。用噴霧器均勻噴涂0.1%茚三酮溶液(展開劑1、2、3所配茚三酮以正丁醇做溶劑，展開劑4所配茚三酮以乙醇做溶劑)，立即用熱風吹風機吹干，即可出現不同位置和顏色的斑點。

(5)Rf值計算。

Rf=原點到色譜點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離

2.2 固定相的優化[10,11]

(1)薄層板。取薄層板1張(22×14 cm)。

(2)點樣。按照2.1優化的最佳點樣方式進行點樣。

(3)展開與顯色。在(500 mL)的燒杯中倒入1 cm的展開層，用鑷子將點好樣的薄層板放入燒杯中，點樣端在下，用封口膜封緊燒杯口，待溶液上升至15～18 cm時，取出薄層板。其余步驟與2.1一致。

2.3 顯色方式的優化[12,13]

(1)濾紙或薄層板準備和點樣方式按照2.1和2.2優化的步驟。

(2)展開與顯色。展開劑為100 mg茚三酮混合4種展開劑，將點樣筒或板放入展開劑中，用封口膜封緊燒杯口，待溶液上升至15～18 cm時，取出濾紙，用鉛筆標記溶劑前沿，吹風機熱風吹干。即可出現不同位置和顏色的斑點，用鉛筆描出斑點輪廓。根據Rf值公式計算各樣品的Rf值。

3 結果與分析[14,15]

3.1 點樣方式優化結果分析

用微量注射器、毛細管和移液槍分別點樣現象，以傳統方法進行分離(固定相：濾紙；流動相：V(正丁醇)：V(冰醋酸)=4∶1；顯色：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液)，微量注射器和毛細管易戳破濾紙而且點樣圈不均勻，不易操作，移液槍點樣5uL量易于控制且點樣圈大小一致，故采用移液槍進行點樣操作。

3.2 固定相優化及展開劑優化結果分析

以濾紙和薄層板固定相載體，以四種不同展開劑為流動相，對4種不同類型的氨基酸進行分離，兩種固定相及四種不同展開劑均能達到明顯分離效果，實驗結果如表1所示。

由表1可知，采用薄層板進行層析分離效果優于濾紙。Rf值表示溶質在支持物上移動的速率，影響Rf值因素很多，主要受物質的結構和極性、支持物、層析所用溶劑、溫度、展開方式、pH及樣品溶液中雜質的影響[5]，在進行氨基酸分離鑒定時薄層色譜層析法比紙色譜層析法更具有速度快、斑點集中和顯色靈敏等優點。

四種不同類型的展開劑均能達到分離目的。結合分離效果、時間和試劑毒性，2號展開劑(V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2)分離效果較好、分離時間較短且毒性較低； 4號展開劑乙醇易揮發使展開劑濃度不準確，展開時間較長，而且展開劑需要臨時配制導致實驗準備工作繁瑣，故不宜采用。

因此，以薄層板做固定相，以2號展開劑(V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2)做流動相，采用移液槍進行點樣操作分離效果最佳。

3.3 顯色方式優化結果分析

以薄層板做固定相，采用移液槍進行點樣操作，展開劑為100 mg茚三酮混合4種展開劑，對4種不同類型的氨基酸進行分離，結果如表2所示。

由表2可知，采用100 mg茚三酮混合2號展開劑(V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2)做流動相，作為新展開劑進行分離，分離速度快，效果明顯，顯色靈敏，實驗時間明顯縮短。綜上所述，將茚三酮加入用V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2的展開劑中做流動相，以薄層板做固定相，移液槍點樣，實驗過程不需要接觸有毒試劑，實驗時間縮短，實驗結果明顯。達到預期目的。

表1 濾紙和薄層色譜層析實驗結果對比

表2 薄層色譜層析優化結果