腎衰康灌腸液含藥血清對HK-2細胞缺氧／復氧損傷的預防作用

鄧榮榮， 羅芯怡， 葉乃菁， 吳新萍， 謝燈飄， 李明權

（1.成都中醫藥大學，四川成都 610075；2.成都中醫藥大學附屬醫院，四川成都 610075）

腎小管上皮細胞過度凋亡是急性腎損傷，尤其是缺血性急性腎損傷發生及惡化的重要機制[1-3］，氧化應激、內質網應激、炎癥機制、鈣超載等均有所參與。其中氧化應激可通過誘導腎小管上皮細胞活性氧簇爆發，啟動細胞凋亡，參與腎臟缺血再灌注損傷[4］和急性腎損傷[5］，成為重要致病機制之一。

前期課題組發現，腎衰康灌腸液對缺氧／復氧損傷的人腎小管上皮細胞 （HK-2）凋亡具有明顯抑制作用。因此，本實驗基于 “治未病”思想，從細胞水平觀察腎衰康灌腸液含藥血清預防HK-2細胞缺氧／復氧損傷的效果，并基于氧化應激探討其作用機制。

1 材料

腎衰康灌腸液 （濃縮型，海南天元制藥廠，批號20130801）。HK-2細胞 （上海生物資源庫）。ROS測定試劑盒 （貨號 Ab39476）、 AKT （貨號 4691 CST）、 NF-κB（貨號6956 CST）、 MAPK （貨號2532 CST） （英國 Abcam公司）；逆轉錄試劑盒 （美國Thermo Scientific公司）；熒光定量試劑盒、LC-96熒光定量PCR儀 （瑞士羅氏公司）。9只健康新西蘭大白兔 （雄性5只、雌性4只）購自成都達碩實驗動物有限公司，體質量 （2.2±0.2）kg，生產許可證號 SCXK（川）2013-17，使用許可證號 SYXK（川）2017-179，于成都中醫藥大學實驗動物中心SPF級半屏蔽系統實驗室以標準飼料分籠飼養，自由飲水，12 h明暗自動切換，保持溫度 （20±2）℃、相對濕度 （60±5）%，適應性喂養7 d后開始實驗。

2 方法

2.1 血清制備 將9只家兔按體質量隨機分成空白組、PBS組、腎衰康灌腸液高劑量組，每組3只?？瞻捉M家兔正常喂養，不進行灌腸給藥；PBS組家兔給予PBS緩沖液灌腸，劑量6.4 mL／（kg·d）；腎衰康灌腸液高劑量組家兔給予腎衰康灌腸液灌腸，劑量6.4 mL／（kg·d）（該劑量是按照人120 mL／d劑量與家兔體表面積的2倍換算得出），每天灌腸4次，每次間隔2～3 h，共3 d。第4天上午完成1次灌腸后，立即對各組家兔進行采血、離心、取上清、過濾除菌操作，得到相應血清，再進一步制備中劑量（50%高劑量含藥血清+50%空白血清）、低劑量 （25%高劑量含藥血清+75%空白血清）含藥血清。

2.2 分組及造模 在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下，以含10%胎牛血清的DMEM／F12細胞培養液傳代培養HK-2細胞。同步化24 h后，將細胞隨機分為對照組、PBS組及含藥血清高、中、低劑量組，其中對照組、PBS組用“2.1”項下含PBS血清培養，含藥血清組用 “2.1”項下相應劑量含藥血清培養。預處理24 h后，PBS緩沖液漂洗細胞，再換常規培養液培養，同時向PBS組、含藥血清組加入 CoCl2原液（250 μmol／L） 以使其終濃度為 500 μmol／L，于37℃培養箱中孵育24 h，進行缺氧／復氧損傷造模。

2.3 細胞凋亡／死亡率檢測 采用CFSE／PI染色、Annexin V-FITC／PI雙染色、流式細胞分析，檢測 “2.2”項下5組細胞造模后0、4、12、24 h凋亡／損傷情況。

2.4 細胞ROS水平檢測 按 “2.2”項下方法常規培養HK-2細胞，同步化24 h后，隨機分為空白組、模型組、預防組，其中空白組、模型組用 “2.1”項下PBS血清培養，預防組用 “2.1”項下高劑量含藥血清培養。預處理24 h后，PBS緩沖液漂洗3組細胞，再換常規培養液培養，同時向模型組、預防組加入CoCl2，按 “2.2”項下方法造模。通過ROS熒光探針結合倒置顯微鏡，檢測3組造模前后0、1、2、4、6、8 h細胞ROS水平。

2.5 AKT、NF-κB、MAPK mRNA表達檢測 采用PCR技術，檢測PBS組、含藥血清組造模后0、4、8、12、24 h細胞AKT、NF-κB、MAPK mRNA表達，PCR引物由上海生物工程技術有限公司合成。其中，AKT正向 AGCGACG TGGCTATTGTGAAG，反向 GCCATCATTCTTGAGGAGGAAG T；NF-κB正向ATGTGGAGATCATTGAGCAGC， 反向CCTGGTCCTGTGTAGCCATT；MAPK正向 TACACCAACCTCTCGTACATCG，反向CATGTCTGAAGCGCAGTAAGATT，反應條件為94℃預變性2 min，94℃ 20 s，60℃ 45 s，循環40次，讀取CT。然后，計算三者CT與內參基因β-actin CT之差ΔCT， 再與PBS組的 ΔCT相減得到 ΔΔCT， 最后通過公式 2T-ΔΔC測定含藥血清組三者表達相對于PBS組的倍數。

2.6 統計學分析 通過SPSS13.0軟件進行處理，數據用s）表示，2組間比較采用Student t檢驗；多組間比較方差齊者采用單因素方差分析，不齊者采用秩和檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 缺氧／復氧損傷對HK-2細胞ROS水平的影響[6］圖1顯示，造模后細胞ROS熒光強度明顯高于造模前，表明以CoCl2進行缺氧／復氧損傷造模時可引起HK-2細胞ROS積聚，誘導細胞發生氧化應激反應。

圖1 缺氧／復氧損傷對HK-2細胞ROS水平的影響

3.2 含藥血清對HK-2細胞CFSE／PI染色的影響 圖2～6顯示，造模后0 h，各組細胞尚未發生凋亡／損傷；造模后4～12 h，各組細胞凋亡／死亡率明顯增加，但含藥血清組明顯低于對照組、PBS組，并以高劑量組最低；造模后24 h，對照組、PBS組、含藥血清低劑量組仍有較低水平的細胞凋亡／損傷存在，而高、中劑量組已回到正常水平。

圖2 含藥血清對HK-2細胞CFSE／PI染色的影響 （0 h）

圖3 含藥血清對HK-2細胞CFSE／PI染色的影響 （4 h）

圖6 含藥血清對HK-2細胞CFSE／PI染色的影響（0～24 h）

3.3 含藥血清對HK-2細胞凋亡／死亡率的影響 圖7～8顯示，造模后0 h，各組細胞均主要分布于雙染陰性左下象限，即細胞凋亡／損傷尚未出現；造模后12 h，各組細胞凋亡分布明顯增多，但含藥血清中、高劑量組表現出明顯的抑制作用 [凋亡／死亡率為中劑量組 （20.9±0.7）%、高劑量組 （18.4±0.7）%， 顯著低于對照組的 （28.1±2.2）%、PBS組的 （27.7±2.5）%， P＜0.05）； 造模后 24 h， 對照組、PBS組能檢測到明顯細胞凋亡，凋亡／死亡率為（22.5±2.2）%，而含藥血清組細胞凋亡已降至較低水平，低、中、高劑量下凋亡／死亡率分別為（10±0.9）%、 （7.7±0.7）%、（6.6±0.7）% 。

圖7 含藥血清對HK-2細胞凋亡／死亡率的影響 （Ⅰ）

圖8 含藥血清對HK-2細胞凋亡／死亡率的影響 （Ⅱ）

3.4 含藥血清對HK-2細胞ROS水平的影響 圖9顯示，各組在造模前均未發現細胞綠色熒光，即均處于氧化還原平衡狀態；造模后模型組細胞出現大量綠色熒光，表明造?？梢餜OS水平明顯增高，細胞發生氧化應激反應。其中預防組明顯少于模型組。圖10顯示，預防組、模型組均在造模后0 h即達到ROS水平峰值，隨后均逐漸減少至消失，但預防組在造模后4 h即基本恢復至正常，而模型組需在造模后8 h。

3.5 含藥血清對HK-2細胞AKT、NF-κB、MAPK mRNA表達的影響 圖11顯示，與PBS組比較，造模后0～4 h含藥血清組 AKT、NF-κB、MAPK mRNA表達下降，4～12 h逐漸升高，而且對NF-κB、MAPK mRNA表達呈現一定劑量依賴性，與PBS組比較有顯著差異 （P＜0.05）。

4 討論

急性腎損傷是一種臨床上常見的綜合征[7］，其中急性腎小管壞死主要由缺血和中毒引起，缺血性可占發病的75%[8］。缺血再灌注性腎損傷是引發缺血性急性腎損傷的重要機制之一，但由于現代醫學對其缺乏切實有效的治療方法，不僅導致病死率高達50%以上[9］，而且有相當數量的患者最終進展為終末期腎病，需長期替代治療。

圖9 造模前后各組HK-2細胞ROS水平比較

腎衰康灌腸液由大黃、黃芪、丹參、紅花組成，作為以急性腎損傷為適應證的唯一應用于臨床的純中藥制劑，臨床療效確切。前期課題組發現，腎衰康灌腸液含藥血清可抑制缺氧／復氧損傷后HK-2細胞凋亡，但它是否對缺氧／復氧損傷誘導HK-2細胞凋亡具有預防作用尚不明確。故本實驗通過CFSE／PI染色、Annexin V-FITC／PI雙染色結合流式細胞分析、ROS熒光檢測、PCR技術，從細胞、基因層面進行考察。

圖10 造模后模型組、預防組HK-2細胞ROS水平比較

圖11 含藥血清對HK-2細胞AKT （A）、NF-κB （B）、MAPK （C） mRNA表達的影響

細胞凋亡是Kerr等[10］在1972年提出的有別于細胞壞死的細胞程序性死亡，而氧化應激是導致細胞病理性過度凋亡的主要機制之一，它可通過ROS等氧化損傷線粒體功能及結構[11］、 升高胞漿內 Ca2+濃度[12］、 激活某些死亡基因程序 （如Bax、P53等）[13］等途徑來導致細胞過度凋亡。本實驗發現，腎衰康灌腸液含藥血清對缺氧／復氧損傷誘導HK-2細胞凋亡具有明顯預防作用，并呈現劑量依賴性，即高劑量下效果最強。ROS檢測發現，腎衰康灌腸液含藥血清預處理對缺氧／復氧損傷誘導HK-2細胞氧化應激反應具有明顯抑制作用，具體表現為細胞ROS集聚明顯減少，而且經PCR檢測發現它對與ROS調節相關的AKT、NF-κB、MAPK等通路[14-15］具有一定調控作用。

綜上所述，腎衰康灌腸液含藥血清可預防HK-2細胞缺氧／復氧損傷，其機制可能與抑制細胞氧化應激、減少細胞ROS過量聚積有關。