參葵通脈顆粒含藥血清對H2O2致乳鼠心肌細胞損傷的保護作用

方慧華， 嚴士海， 周仲瑛， 李七一

（1.南京中醫藥大學附屬醫院藥學部，江蘇南京 210029；2.南京中醫藥大學附屬醫院藥理室，江蘇南京 210029；3.南京中醫藥大學附屬醫院心內科，江蘇南京 210029）

雖然目前對慢性心力衰竭的治療取得了重大進展，但其發病率和死亡率仍然非常高，代謝功能障礙是該疾病的重要基礎機制[1-2］，氧化應激可導致心肌細胞結構損傷和功能紊亂，是慢性心衰、心肌重塑、心肌缺血再灌注等多種心血管疾病發生發展的關鍵環節[3］。參葵通脈顆粒是課題組傳承國醫大師周仲瑛教授治療慢性心力衰竭臨床經驗所創制的醫院制劑，其安全有效，可改善心功能、抗氧化應激[4］。本實驗通過心肌細胞氧化應激損傷模型和血清藥理學研究方法，觀察參葵通脈顆粒對心肌細胞氧化應激損傷的保護作用，特別是對糖脂代謝紊亂的調控作用，為相關臨床治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 新生3 d內SD乳大鼠，雌雄兼有；8周齡SD大鼠，雄性，均由南通大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（蘇）2014-0001。

1.2 試藥 參葵通脈顆粒，組方炙黃芪20 g、靈芝20 g、仙靈脾10 g、桂枝 10 g、丹參 10 g、黃蜀葵 10 g、茯苓10 g、陳皮6 g。將桂枝、陳皮置于減壓濃縮罐中，加6倍量水蒸餾提取，收集揮發液，濾取多余煎液；余下6味藥與上述2味藥的藥渣合并，置于多功能提取罐中，加水煎煮2次，第1次加10倍量水浸泡0.5 h后煎煮1 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.22（70～75℃）的清膏。揮發液二次蒸餾，收集揮發油，乙醇溶解后加入含β-環糊精的飽和水溶液中攪拌3 h，0～4℃下冷藏過夜，抽濾，收集濾餅，40℃下干燥，得包合物。取適量糊精加到包合物中，流化床制粒，70℃下干燥，制粒，即得。由江蘇省中醫院制劑部提供，批號20170612。二甲基亞砜 （DMSO）、H2O2、胰酶均購于美國Sigma公司；放射免疫沉淀分析裂解液、增強型雙金雞寧酸 （BCA）蛋白濃度檢測試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）試劑盒、細胞核蛋白與胞質蛋白抽提試劑盒、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG均購自于凱基生物科技有限公司；磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 （p-AMPKα）、 腺苷酸活化蛋白激酶 （AMPKα）、 葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）、 脂肪酸轉位酶 （FAT／CD36）、 肉毒堿琥珀酰轉移酶-1（CPT-1）兔抗大鼠多克隆抗購于美國Cell Signaling公司；乳酸脫氫酶 （LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、丙二醛 （MDA）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 HF151UVCO2培養箱 （上海力申科學儀器有限公司）；倒置顯微鏡 （日本 Olympus公司）；凈化工作臺（上海手術器械廠）；酶標儀 （瑞士Tecan公司）。

2 方法

2.1 含藥血清制備 將SD大鼠隨機分成4組 （每組10只）：參葵通脈顆粒低劑量組，4.32 g生藥／kg，劑量為人臨床等效劑量的1／2，取4.32 g溶入10 mL蒸餾水中；參葵通脈顆粒中劑量組，8.64 g生藥／kg，劑量為人臨床等效劑量，取8.64 g溶入10 mL蒸餾水中；參葵通脈顆粒高劑量組，17.28 g生藥／kg，劑量為人臨床等效劑量的2倍，取17.28 g溶入10 mL蒸餾水中；空白血清組不給藥，給予等量蒸餾水 （上述藥物配置的溶劑）灌胃，每天1次，連續14 d。然后，大鼠腹主動脈取血，離心，收集血清，-80℃下保存備用。

2.2 心肌細胞培養 取SD乳大鼠10只，浸入75%乙醇中使其窒息死亡，移入超凈臺內，2%碘酊、75%酒精消毒皮膚，眼科鑷和眼科剪打開胸腔，取出心臟置于平皿中，冰冷緩沖液沖洗3次，剪成1～2 mm3碎塊，消化液在37℃下水浴消化8次，每次10 min，前2次消化液中含有較多的血細胞碎屑，棄去，收集后6次消化液，加等體積含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液終止消化，1 000 r／min離心5 min，棄去上清液，加完全培養液將細胞沉淀混勻，制成心肌細胞懸液，移到培養瓶，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中，每天更換培養液1次，待心肌細胞均貼壁生長出偽足連成片狀后，即可用于實驗。

2.3 分組、建模及給藥 將培養好的乳鼠心肌細胞隨機分為5組：正常對照組，心肌細胞+空白血清；模型組，心肌細胞+H2O2+空白血清；參葵通脈顆粒低劑量組，心肌細胞+H2O2+低劑量參葵通脈顆粒；參葵通脈顆粒中劑量組：心肌細胞+H2O2+中劑量參葵通脈顆粒；參葵通脈顆粒高劑量組：心肌細胞+H2O2+高劑量參葵通脈顆粒。參考文獻 [5-6］， 細胞采用含有 H2O2（100 μmol／L） 的培養液（30%H2O2的濃度大約為 1×107μmol／L， 將其加到 1 mL 完全培養液中，再吸取上述液體10 μmol／L加到10 mL完全培養液中，即得）刺激大鼠原代心肌細胞2 h，造成心肌細胞氧化應激損傷。根據上述分組情況，加入相應的含10%含藥血清的培養液，而正常對照組與模型組加入含10%空白血清的培養液，繼續培養24 h，采集細胞，養上清液。

2.4 細胞上清液中LDH、CK-MB、MDA水平檢測 取細胞培養上清液，按照試劑盒說明書加入試劑，采用分光光度法檢測LDH、CK-MB、MDA水平。

2.5 細胞內ATP水平檢測 細胞按照試劑盒說明書比例加入裂解液，裂解時用移液槍反復吹打以使裂解液充分接觸裂解細胞，4℃、12 000 r／min下離心5 min，取上清，酶標儀檢測光密度，BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定各組蛋白濃度，進而檢測細胞內ATP水平。

2.6 p-AMPKα、 AMPKα、 GLUT4、 FAT／CD36、 CPT-1 表達檢測 嚴格按試劑盒操作提取心臟總蛋白，BCA法定量蛋白。采用Western blot法，取蛋白40 g加入緩沖液變性，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF膜，染色觀察條帶，TBST洗膜，5%脫脂牛奶 TBST封閉1 h，分別加兔抗大鼠 p-AMPKα、 AMPKα、 GLUT4、 FAT／CD36、CPT-1抗體，室溫下孵育2 h，TBST洗膜，加二抗反應1 h，TBST洗膜，ECL發光試劑發光。通過凝膠圖像分析軟件進行吸光度掃描，計算 p-AMPKα、AMPKα、GLUT4、FAT／CD36、CPT-1蛋白條帶的吸光度與β-actin的比值。

2.7 統計學分析 通過SPSS17.0軟件進行處理，計量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 參葵通脈顆粒對 LDH、CK-MB、MDA水平的影響 表1顯示，與正常對照組比較，模型組LDH、CK-MB、MDA水平顯著升高 （P＜0.05）；與模型組比較，參葵通脈顆粒組三者水平顯著降低 （P＜0.05）。

表1 參葵通脈顆粒對LDH、CK-MB、MDA水平的影響 （ n＝8）

表1 參葵通脈顆粒對LDH、CK-MB、MDA水平的影響 （ n＝8）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

--組別 LDH／（U·L1） CK-MB／（U·mL1） MDA／（nmol·mL-1）正常對照組 183.63±33.70 0.48±0.13 2.05±0.64模型組 529.87±63.36? 1.26±0.41? 17.95±2.64?參葵通脈顆粒低劑量組 399.34±52.98# 0.75±0.38# 9.32±1.52#參葵通脈顆粒中劑量組 329.65±59.41# 0.68±0.29# 7.73±2.33#參葵通脈顆粒高劑量組 306.42±52.02# 0.61±0.27# 6.82±1.37#

3.2 參葵通脈顆粒對ATP水平的影響 表2顯示，與正常對照組比較，模型組ATP水平顯著降低 （P＜0.05）；與模型組比較，參葵通脈顆粒組 ATP水平顯著升高 （P＜0.05）。

表2 參葵通脈顆粒對ATP水平的影響 （ n＝8）

表2 參葵通脈顆粒對ATP水平的影響 （ n＝8）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 ATP（nmol·mg-1）正常對照組 12.91±1.39模型組 2.76±0.88?參葵通脈顆粒低劑量組 6.79±1.19#參葵通脈顆粒中劑量組 8.48±1.71#參葵通脈顆粒高劑量組 9.19±2.02#

3.3 參葵通脈顆粒對p-AMPKα、AMPKα、GLUT4、FAT／CD36、CPT-1表達的影響 表3、圖1，與正常對照組比較，模型組 p-AMPKα／AMPKα表達顯著升高 （P＜0.05），GLUT4、 FAT／CD36、 CPT-1表達顯著降低 （P＜0.05）； 與模型組比較，參葵通脈顆粒組四者表達顯著升高 （P＜0.05）。

表3 參葵通脈顆粒對p-AMPKα、AMPKα、GLUT4、FAT／CD36、CPT-1表達的影響 （， n＝8）

表3 參葵通脈顆粒對p-AMPKα、AMPKα、GLUT4、FAT／CD36、CPT-1表達的影響 （， n＝8）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 p-AMPKα／AMPKα GLUT4／β-actin FAT／CD36／β-actin CPT-1／β-actin正常對照組 0.23±0.05 1.08±0.15 0.47±0.07 0.45±0.08模型組 0.55±0.07? 0.41±0.08? 0.09±0.04? 0.08±0.03?參葵通脈顆粒低劑量組 1.01±0.12# 0.61±0.06# 0.26±0.04# 0.25±0.04#參葵通脈顆粒中劑量組 1.51±0.16# 0.80±0.06# 0.31±0.08# 0.34±0.05#參葵通脈顆粒高劑量組 1.90±0.13# 0.95±0.15# 0.46±0.08# 0.42±0.04#

圖 1 各組 p-AMPKα、 AMPKα、 GLUT4、 FAT／CD36、CPT-1表達

4 討論

近年來研究表明，心肌能量代謝障礙是慢性心力衰竭的發生機制之一，該疾病發生時心肌氧化應激嚴重，線粒體損傷，從而導致能量代謝障礙[7］。正常情況下，心肌細胞能利用多種能量底物 （脂肪酸、葡萄糖等），其中脂肪酸供給心臟60%～80%的能量，是主要來源，而發病時脂肪酸代謝受到抑制，糖酵解相對增加[8］。本實驗發現，參葵通脈顆粒對氧化應激導致的心肌細胞能量代謝損傷具有良好的改善作用。

參葵通脈顆粒由炙黃芪、靈芝、淫羊藿、桂枝、丹參、黃蜀葵、茯苓、陳皮等組成，方中炙黃芪益氣養元，扶正祛邪，養心通脈，健脾利濕，為補氣之要藥[9］；靈芝補氣安神，止咳平喘，延年益壽，用于心神不寧、失眠心悸、肺虛咳喘、虛勞短氣、不思飲食[10］，兩者共為君藥，共奏補心氣、安心神之功效；淫羊藿與桂枝共為臣藥，前者補腎陽，強筋骨，正合慢性心力衰竭心腎陽虛、失于溫運的病機[11］，而后者既可溫扶脾陽以助運水，又可溫腎陽、逐寒邪以助膀胱氣化，而行水濕痰飲之邪[12］，與前者同用時可溫陽化氣，增強君藥補氣行血之力；丹參、黃蜀葵、茯苓養血活血利水，共為佐藥，發病時心腎陽氣虧虛，不能推動血液運行，血脈不利，水飲內停，而丹參功效活血祛瘀、安神寧心，黃蜀葵功效利尿通淋、活血、止血、消腫解毒，茯苓功效滲濕利水、寧心安神，三者合用，有行瘀血而新血不傷、養新血而瘀血不滯之功效；陳皮理氣健脾，燥濕化痰，用于發病時水濕困脾之脘腹脹滿，并可改善胃腸蠕動，促進諸藥吸收，亦為佐藥。諸藥合用，攻補兼施，扶正不留邪，祛邪不傷正，可促進泵功能恢復。

心肌細胞氧化損傷時，線粒體能量代謝障礙，細胞膜完整性遭到破壞，細胞通透性增加，膜內酶外漏，而測定細胞培養上清液中LDH、CK-MB水平可反映細胞損傷程度。本實驗通過H2O2建立心肌細胞損傷模型，發現模型組LDH、CK-MB釋放增加，與正常對照組比較有顯著差異，表明細胞損傷嚴重；參葵通脈顆粒能顯著抑制兩者外漏。MDA是一種脂質過氧化標志物，本實驗發現不同劑量參葵通脈顆粒均能顯著降低其水平，推測它具有抗自由基和穩定細胞膜的作用。

線粒體氧化應激水平增加時，可使其三磷酸腺苷合成減少[13］，AMPK被認為是細胞的 “油量表”，可檢測發現低能量狀態，此時磷酸化增加，激活內源性保護蛋白，改善能量代謝[14］。本實驗發現，正常對照組p-AMPK表達較低，而受到氧化應激刺激后略有增加；參葵通脈顆粒可促進AMPK磷酸化，改善心肌細胞代謝障礙。

脂肪酸是心肌細胞產生ATP能量的主要底物，CD36是心臟FAT的主要形式，為心臟利用和吸取脂肪酸的主要轉位酶[15］；CPT-1是心肌細胞線粒體利用脂肪酸的關鍵酶，可促進脂肪酸進入線粒體氧化[16］，當心肌細胞發生損傷時，FAT／CD36、CPT-1表達下調，表明脂肪酸代謝障礙。本實驗發現，參葵通脈顆粒可促進FAT／CD3、CPT-1，改善脂肪酸代謝障礙。

GLUT4負責細胞內外葡萄糖轉移和運送，保護心肌細胞在氧化應激損傷中生存足夠的能量[17］。本實驗發現，參葵通脈顆粒可促進GLUT4表達，從而提高葡萄糖利用。

綜上所述，參葵通脈顆粒對H2O2致乳鼠心肌細胞損傷具有良好保護作用，可促進細胞存活，抑制心肌酶譜分泌，其機制可能與調控糖脂代謝酶、改善心肌細胞能量代謝障礙有關。