豇豆枯萎病拮抗木霉MA4菌株的分離與鑒定

申君 楊紹麗 吳仁鋒

摘要：為篩選能有效抑制豇豆枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. tracheiphilum）的生防真菌，采用平板稀釋法和平板對峙法從武漢設(shè)施蔬菜根際土壤中分離、純化、篩選出一株優(yōu)勢拮抗真菌MA4，根據(jù)形態(tài)學(xué)和菌株18S rDNA序列對MA4菌株進(jìn)行鑒定，采用平板對峙法對其抑菌活性和穩(wěn)定性進(jìn)行測定，并進(jìn)行盆栽防效試驗(yàn)。結(jié)果表明，MA4對豇豆枯萎病菌的抑制率為75.69%;根據(jù)其形態(tài)學(xué)鑒定和18S rDNA序列分析，確定MA4菌株為哈茨木霉（Trichoderma harzianum），將該序列在GenBank中進(jìn)行注冊登錄，登錄號為MH539514。MA4菌株對番茄灰霉病菌、辣椒根腐病菌、西瓜枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、茄子褐紋病菌、番茄早疫病菌、茄子爛稈病菌和番茄果腐病菌等8種病原菌均具有良好的抑制作用，抑制率為62.12%～86.93%;MA4菌株經(jīng)10代繼代培養(yǎng)后，對豇豆枯萎病菌的抑制率仍為80.86%。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，接種14 d后施加MA4發(fā)酵液的處理病情指數(shù)為11.85%，防效達(dá)85.75%，且對豇豆植株具有一定促生作用。

關(guān)鍵詞：豇豆枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. tracheiphilum）; 分離與鑒定; 拮抗菌; 哈茨木霉（Trichoderma harzianum）

中圖分類號：S436.43? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）02-0079-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.018? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

豇豆[Vigna unguiculata （L.） Walp.]是一種世界性的豆科蔬菜，主要分布在溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū)[1]，在中國各地均有種植。豇豆枯萎病是由半知菌亞門真菌尖孢鐮刀菌嗜導(dǎo)管專化型（Fusarium oxsyporum schl. f. sp. tracheiphlium，F(xiàn)OT）侵染引起的一種毀滅性土傳病害[2]，在高溫高濕條件下，可導(dǎo)致豇豆減產(chǎn)70%左右[3]。

目前，防治豇豆枯萎病主要是采用化學(xué)防治，但化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境破壞、次要病害猖獗、蔬菜農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問題，直接影響了蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。因此，分布廣、繁殖快、適應(yīng)性強(qiáng)、抗菌譜廣且能促進(jìn)植物生長的生防真菌-木霉菌（Trichoderma spp.）成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。木霉菌是一種廣譜的拮抗菌，至少對18個屬中的29種植物病原菌具有拮抗作用，尤其對立枯絲核菌、鐮刀菌、疫霉菌等引起的土傳病害具有較好的防治效果[5]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)木霉菌在水稻枯萎病、香蕉枯萎病、草莓根腐病、玉米立枯絲核菌等土傳病害上均有較好的抑制效果[5-9]，此外，木霉菌在黃瓜、苦瓜等蔬菜病害上有很好的防效，研究發(fā)現(xiàn)猥木霉（Trichoderma erinaceum）對黃瓜枯萎病菌的抑制率達(dá)到79.04%，盆栽防效高達(dá)87.5%[10];深綠木霉（Trichoderma atroviride）T52和平菇木霉（Trichoderma pleurotum）32080對黃瓜枯萎病菌的抑制率分別為86.3%和79.0%，其盆栽防效均超過60%[11];哈茨木霉菌對苦瓜葉斑病原菌鏈格孢屬菌絲的生長具有抑制作用，其抑制率為70.4%～88.1%[12]。

目前，從設(shè)施蔬菜根際土壤中篩選豇豆枯萎病拮抗真菌的報道較少。本研究從武漢設(shè)施蔬菜根際土壤中篩選到一株對豇豆枯萎病菌具有較好防效的拮抗木霉菌MA4，對其進(jìn)行鑒定，同時對其抑菌譜和穩(wěn)定性進(jìn)行測定，并進(jìn)行盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其防效，以期為設(shè)施蔬菜的生物防治提供新的微生物資源。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試菌株：豇豆枯萎病菌、番茄果腐病菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、茄子爛稈病菌（Phomopsis vexans）、茄子褐紋病菌（Phomopsis vexans）、辣椒根腐病菌（Fusorium oxysporum Schlecht）和黃瓜枯萎病菌（Fusorium oxysporum f. sp. cucumerinum）均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存，番茄早疫病菌（Alternaria sonali）和西瓜枯萎病菌（Fusorium oxysporum f. sp. niveum）由長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院惠贈。

馬丁氏培養(yǎng)基（MA）：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、K2HPO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、孟加拉紅0.03 g、瓊脂20 g、加去離子水定容至1 L，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌30 min。使用時每毫升培養(yǎng)基中加入30 μg鏈霉素以抑制放線菌生長。

固體和液體馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g（液體PDA則不加）、去離子水1 L，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品采集與處理? 供試9份根際土壤樣品于2017年6月在黃陂區(qū)武湖基地黃瓜、番茄、辣椒、豇豆、芹菜和紫背天葵等設(shè)施蔬菜田塊采集。樣品自然風(fēng)干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 真菌的分離? 采用平板稀釋法[13]：取土樣5 g，加無菌水45 mL，置于全溫培養(yǎng)搖床28 ℃振蕩30 min，即為濃度10-1的土樣，用無菌水依次稀釋為10-2和10-3，每個濃度取100 μL涂布于馬丁氏平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)菌落的大小、形狀等培養(yǎng)特征，挑取不同的單菌落于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化并編號，PDA斜面4 ℃保存。

1.2.3? 拮抗菌的篩選? 拮抗菌的初篩：參照起登風(fēng)等[14]的方法，以豇豆枯萎病菌（FOT）為靶標(biāo)菌，對分離到的真菌進(jìn)行拮抗活性初篩。將FOT接種于PDA平板上培養(yǎng)5 d，用打孔器打成直徑為5 mm的菌餅，接種于PDA平板中央，在距中央FOT 2.5 cm處對稱接種4株上述分離純化得到的菌株，使病原菌與分離的菌株呈十字交叉排列（病原菌在十字的中央，分離所得的菌株在十字的兩端），以僅在中央接病原菌為對照，倒置于培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)5 d，記錄病原菌半徑，觀察是否有拮抗活性。3次重復(fù)。

拮抗菌的復(fù)篩：采用平板對峙法[15]對上述獲得的具有拮抗效果的真菌菌株進(jìn)行復(fù)篩。將FOT和具有拮抗效果菌株同步進(jìn)行活化5 d至菌落分布均勻，用打孔器打成直徑5 mm的菌餅，分別將具有活性的菌株和病原菌同時接種在內(nèi)徑9 cm的PDA平板上，菌餅圓心相距約4.5 cm，連線經(jīng)過平板圓心;以僅接病原菌為對照。接種后的平板倒置28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，測量病原菌對照菌落半徑和病原菌菌落指向拮抗菌的半徑。重復(fù)3次。按下面公式計算拮抗菌株對病原菌的抑菌率[16]。

1.2.4? 拮抗菌株形態(tài)學(xué)鑒定? 將待鑒定菌株接種到PDA平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和顏色，5 d后制作玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)特征。

1.2.5? 拮抗菌株MA4 18S rDNA PCR擴(kuò)增和序列分析? 按OMEGA HP Fugal DNA Kit說明書提取基因組DNA，選用真菌18S rDNA通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′對菌株MA4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL PCR反應(yīng)體系：10 μmol/L的引物ITS1/ITS4各1 μL、I-5TM 2X High-Fidelity Master Mix 10 μL、DNA模板1 μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，35個循環(huán);72 ℃ 10 min;16 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將測得的基因序列在NCBI中通過BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比分析（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），用MEGA6.0.6軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和聚類分析（Boot-strap=1 000），分析親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育。

1.2.6? 拮抗菌株MA4抑菌譜測定? 利用平板對峙法在PDA平板培養(yǎng)基上測定MA4菌株對番茄果腐病、茄子爛稈病、茄子褐紋病、辣椒根腐病、黃瓜枯萎病、草莓灰霉病、番茄早疫病和西瓜枯萎病等8種蔬菜病害病原菌的抑制作用。分別以僅接病原菌為對照，接種后的平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10 d，測量病原菌對照菌落半徑和病原菌落指向拮抗菌的半徑。3次重復(fù)。

1.2.7? 拮抗菌株MA4穩(wěn)定性測定? 在PDA培養(yǎng)基平板上對篩選到的MA4菌株連續(xù)進(jìn)行10代繼代培養(yǎng)，并每一代以FOT為指示菌，利用平板對峙法測定MA4菌株拮抗活性的穩(wěn)定性。

1.2.8? 拮抗菌株MA4盆栽防效測定? 將種子用55 ℃溫水浸泡30 min左右，清水清洗干凈后播種，當(dāng)幼苗長齊2片真葉時拔出，抖落根部土壤，用清水沖洗干凈根系，剪去根尖部分，浸入豇豆枯萎病菌孢子懸浮液（2.0×107 CFU/mL）中30 min，再移植到花盆中，置于大棚內(nèi)培養(yǎng)。在接種病原菌7 d后做如下處理：①用MA4菌株發(fā)酵濾液灌根8 mL/株;②清水灌根8 mL/株為對照;再過7 d第1次統(tǒng)計病情指數(shù)，14 d第2次統(tǒng)計病情指數(shù)。在第1次病情統(tǒng)計結(jié)束后及時進(jìn)行第2次灌根處理。

每處理3次重復(fù)，每重復(fù)10株。按時統(tǒng)計幼苗發(fā)病情況。計算病情指數(shù)和防治效果。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 拮抗真菌的分離及拮抗效果

利用土壤稀釋分離法從采集的9份土樣中分離純化得到真菌45株，分別將其命名為MA1～MA45。以FOT為靶標(biāo)菌，采用十字交叉法篩選出10株對FOT具有抑菌活性的拮抗菌株。采用平板對峙法對10株拮抗菌株進(jìn)行復(fù)篩，10個菌株對FOT的抑制率均超過50%，其中，MA4菌株抑菌效果最好（表1），對FOT的抑制率為75.67%，與其他菌株相比差異顯著，且MA4菌株生長速度快，4 d左右長滿培養(yǎng)皿，豇豆枯萎病菌基本停止生長。

2.2? 拮抗真菌的鑒定

2.2.1? 形態(tài)學(xué)鑒定? 在PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)，MA4菌株的菌落生長迅速，初期菌絲呈白色卷毛狀，72 h菌絲基本長至培養(yǎng)皿邊緣，繼續(xù)培養(yǎng)，菌落顏色逐漸由淺綠色變?yōu)榘稻G色，氣生菌絲多，背面呈黃綠色。分生孢子梗主分枝稍微向頂端彎曲，主分支上有2～3個次級分支;瓶梗基部明顯溢縮，頂部變細(xì)，在分生孢子梗尖端有2～5個渦狀排列或單生且與主軸呈90°夾角;分生孢子橢圓形或近球形。參照上海交通大學(xué)木霉菌菌種保藏管理中心（http：//www.china-cctc.org）對哈茨木霉菌形態(tài)分類鑒定的描述，初步確定MA4菌株為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。

2.2.2? 分子鑒定? 利用真菌 TSl/ITS4對MA4菌株18S rDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)序列分析得到666 bp的片段。將獲得的序列與已在NCBI上登記的19種木霉菌的ITS序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)MA4菌株與哈茨木霉菌的相似性為99%，進(jìn)一步證明MA4菌株為哈茨木霉菌，將該序列在GenBank中進(jìn)行注冊登錄，登錄號為MH539514。

2.3? 拮抗菌株MA4菌株的抑菌譜

采用平板對峙法測定番茄灰霉病、辣椒根腐病、西瓜枯萎病、黃瓜枯萎病、茄子褐紋病、番茄早疫病等8種病原菌的抑制作用。結(jié)果（表3）表明，MA4菌株對8株供試病原菌具有不同的抑菌活性。其中對番茄灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率為86.93%，與其他病原菌之間差異顯著;對番茄果腐病菌的抑制效果相對較差，但抑制率也在60%以上。對其他6種病菌的抑制率均在70%以上。由此可見，MA4菌株抗菌譜較廣，抑菌效果較好。

2.4? 拮抗菌株MA4的穩(wěn)定性

利用平板對峙法連續(xù)10代測定真菌MA4對FOT的抑制作用，結(jié)果如表4所示。拮抗真菌MA4對FOT的抑制率均超過75%，表明真菌MA4具有較穩(wěn)定的拮抗活性。

2.5? 拮抗菌株MA4盆栽防治效果

采用灌根接種法測定MA4菌株（7.20×107?CFU/mL）發(fā)酵濾液對豇豆枯萎病的防治效果。結(jié)果（表5）表明，接種7 d時對照組病情指數(shù)為41.00，MA4處理組病情指數(shù)僅為0.37，而14 d時對照組病情指數(shù)高達(dá)83.14，MA4處理組病情指數(shù)為11.85，MA4處理對豇豆枯萎病菌的防治效果為85.75%，且對豇豆植株有一定促生長作用。

3? 小結(jié)與討論

本研究從武漢設(shè)施蔬菜根際土壤中篩選出一株對豇豆枯萎病菌的抑制率達(dá)到75.69%的真菌菌株MA4，根據(jù)菌落形態(tài)、形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA的ITS序列分析，確定該菌株為哈茨木霉，并將該序列在GenBank中進(jìn)行注冊登錄，登錄號為MH539514。哈茨木霉是目前木霉屬中研究較多且潛力較大的生防菌，適應(yīng)性好，生長范圍廣，可以通過競爭、重寄生、分泌抗生物質(zhì)等途徑對病原菌產(chǎn)生作用，對黃瓜灰霉病、白粉病、葉霉病、菌核病、霜霉病、玉米立枯病、香蕉枯萎病、苦瓜葉斑病、棉花枯萎病、棉花黃萎病、黃瓜枯萎病、小麥根腐病、草莓根腐病等均有顯著防效[7-9，12，17-21]。

生防菌是植物病害防治的主要趨勢，但在實(shí)際應(yīng)用中存在活菌的存活率、定殖、繁殖能力、穩(wěn)定性等問題，因此篩選出穩(wěn)定性高、抑菌譜廣的高效生防菌株對植物病害的防治具有重要意義[22]。本研究篩選出的哈茨木霉菌株MA4對豇豆枯萎病菌的抑制率達(dá)到75.69%，抑菌譜測定發(fā)現(xiàn)其對番茄灰霉病菌、辣椒根腐病菌、西瓜枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、茄子褐紋病菌、番茄早疫病菌、茄子爛稈病菌和番茄果腐病菌均有較好的拮抗作用，抑制率在62.12%～86.93%;且穩(wěn)定性高，繼代培養(yǎng)10代后，其對豇豆枯萎病菌的抑菌率仍有80.86%。盆栽試驗(yàn)表明，接種14 d后防治效果達(dá)85.75%，且對豇豆植株具有一定促生作用。由此可見，哈茨木霉菌株MA4是具有生防潛力的菌株，下一步將對其發(fā)酵條件和生防機(jī)理等進(jìn)行研究，為研制綠色生物菌劑提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

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