自然流產的遺傳學檢測研究進展

劉祥舉

自然流產（Spontaneous Abortion，SA）發病率占確診妊娠案例的10%～15%，其病因復雜，相關研究認為遺傳特別是染色體異常是導致SA的主要因素[1-2]。染色體異常包括染色體數目異常、結構異常、多倍體以及嵌合體等[3]。目前臨床上染色體異常的遺傳學檢測方法包括G顯帶染色體核型分析、熒光原位雜交技術（fluorescent in situ hybridization，FISH）、熒光定量PCR（quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR）、多重連接探針擴增技術（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、染色體微芯片技術（chromosomal microarray，CMA）以及下一代測序技術（nextgeneration sequencing，NGS）等[4]。SA 能增加再次妊娠失敗的發生率及其他妊娠合并癥的發病率。采用合適的檢測方法對染色體情況進行分析，闡明SA病因，對再次妊娠有重要的指導意義。因此，本文就SA的遺傳學檢測技術研究進展進行綜述，旨在為臨床選擇合適的染色體異常檢測方法提供參考。

1 自然流產概述

SA是產科最常見的妊娠合并癥。據報道大約有10%～15%已確診的妊娠會在妊娠20周前發生自然流產[1-5]。根據流產發生時間的不同，將孕12周前流產稱為早期流產，孕12周及以后的自然流產稱為晚期流產。根據流產次數將與同一性伴侶連續遭受2次或2次以上的自然流產稱為復發性自然流產[6]。目前已知的自然流產誘發因素眾多，涉及遺傳、免疫、感染、內分泌、環境及其他未知因素等[7]。遺傳因素中染色體異常是目前公認的導致SA的最主要因素，超過50%的SA是由染色體異常引起的[8]。染色體異常的類型有染色體數目異常、染色體結構異常、嵌合體及多倍體等。在SA病例中，染色體數目異常出現頻率最高（高達90%），結構異常約占6%，其他嵌合體約占1-2%，而多倍體出現頻率較低[9-10]。SA并發癥眾多，不利于孕婦的身心健康，且隨著流產次數的增加，提升了再次妊娠流產的幾率[11]。目前，對于遺傳因素引起的SA尚無有效診治方法。對流產物及孕婦夫妻雙方進行染色體排查，并結合遺傳咨詢和輔助生殖手段，對再次妊娠的指導具有重要的意義。

2 自然流產的主要遺傳學檢測技術

染色體異常是SA的主要原因，其檢測常通過采集流產組織、刮宮組織、引產組織等樣品，從中挑取由受精卵發育成的胎兒、胚胎或絨毛等組織進行細胞培養或者DNA提取，采用分子生物學檢測方法對其進行檢測，通過對其染色體異常狀況進行分析，再結合夫妻雙方的遺傳背景輔助分析發生SA的遺傳因素，為后續的生育提供科學依據和合理指導。臨床上常見的SA遺傳學檢測方法有以下幾種。

2.1 G顯帶染色體核型分析

G顯帶染色體核型分析是流產物染色體檢測的“金標準”[4]。該方法通過對流產物進行細胞培養后制備染色體標本，利用顯微鏡觀察染色體數目及形態結構進而分析檢測結果。核型分析技術優點在于能夠檢測染色體的數目異常（如三體、單體或多倍體）和5兆堿基（mega base，Mb）以上的結構異常（如易位、倒位）[12]，尤其是對染色體平衡易位的檢測是其他分子生物學方法無法取代的。此外，G帶帶型的相對穩定也使得該技術仍在臨床上應用最為普遍[13]。張建林、朱蕊等[2，14]通過對自然流產絨毛細胞培養及染色體核型分析證實了胚胎染色體異常是造成自然流產的重要原因；邱惠國、王瑾等[15-16]分別通過G顯帶染色體核型分析技術檢測出了染色體數目異常、染色體結構異常（包括平衡易位、羅伯遜易位、倒位、插入和缺失等）及染色體多態性，證實染色體核型異常是導致不孕不育、SA的主要原因。由此可見，G顯帶核型分析技術可以檢出多種染色體異常類型，為SA病因分析提供了全面指導，同時對流產夫婦雙方的染色體核型輔助分析也為胚胎停育的病因分析提供了依據。G顯帶染色體核型分析技術雖然有其不可替代的優勢，但該技術主要依賴于細胞培養，培養過程容易受到母體細胞污染，且在實際臨床應用中常常出現因為所取流產物過于陳舊影響染色體的制備情況，進而影響檢測結果；甚至因為其冗長的培養過程使檢測周期可長達一個月，這些都在一定程度上限制了其在臨床上的應用，同時也促進了其他分子生物學技術的誕生。

2.2 熒光原位雜交技術

核型分析技術的局限性使得FISH技術逐漸應用于流產物的檢測。FISH技術是將熒光標記的已知核酸序列作為探針，與待檢測染色體中的靶序列進行雜交，然后在熒光顯微鏡下觀察熒光信號從而分析待測樣本染色體情況[17]。該技術免去了細胞培養這一復雜且失敗率高的步驟，從標本制備到患者拿到報告這一過程僅需24～48 h，極大程度地縮短了臨床報告時間，這些優勢在一定程度上彌補了G顯帶染色體核型分析技術的不足，使其在流產物的檢測中得到一定程度的應用[4，17]。Leung 等[18]對大樣本研究結果顯示的極高成功率更是證實了FISH技術應用于流產物檢測的可行性，國內近年來的研究也顯示了該技術用于流產物檢測的高成功率[19，20]，這些證據為FISH的臨床應用提供了信心。然而，FISH技術的高成功率僅表現于對染色體數目異常的檢測，其對染色體的結構異常亦無能為力。而且由于該技術探針的局限性，常常僅針對常見的已知染色體異常進行檢測。綜合其檢測成功率、成本、操作及實驗周期等因素，該技術目前在臨床上仍有一定的應用比例。

2.3 熒光定量PCR

QF-PCR技術是采用多對經熒光標記的引物對染色體特異的多態性短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）進行PCR擴增，然后對PCR產物進行毛細管電泳，再根據引物熒光信號強度比較雜合性STR位點雙峰的比值，進而診斷染色體數目。該技術在1993年首次應用于染色體異常的檢測，因其報告時間短、自動化程度高、價格相對便宜，迅速在臨床上得到廣泛應用[21]。Coelho等[22]采用QF-PCR對130例流產樣本的染色體異常檢測結果（54.6%）顯示了其與常規染色體核型分析結果（48%）的一致性，且檢出8例（11.3%）多倍體亦與傳統的細胞遺傳學檢測結果（12%）相符，證實了QF-PCR技術用于染色體非整倍體及多倍體檢測的可靠性。此外，該技術還可以根據STR位點判斷染色體的來源，排除母體污染情況，為下次妊娠提供更多的遺傳咨詢信息[23]。目前國內外已經有成熟的商品化試劑盒，如Aneufast、TrueScienceTMAneuploidy STR Kits以及達安基因自主研發生產的21三體和性染色體多倍體檢測試劑盒等。然而，這些試劑盒都只對21、18、13及X和Y 5條染色體進行檢測，并不能檢測剩余染色體的數目異常，也不能檢測染色體的結構異常，同時，尚未有基于中國人群STR位點的大樣本研究數據，這也是目前QF-PCR多被應用于產前診斷的原因。

2.4 多重連接探針擴增技術

2002年，Schouten 等[24]報道了一種可于同一反應管中同時檢測40個不同核苷酸序列的拷貝數變化的新方法。MLPA為一種定性和半定量技術，每一個待測基因均包含一長一短的兩個熒光標記探針，這對探針能夠與染色體靶序列進行分子雜交，經連接酶連接、多重PCR擴增后將產物用序列基因分析儀電泳分析檢測結果。MLPA技術具有通量相對高（可同時檢測幾十個樣本）、速度快（24～48 h可得到檢測結果）、分辨率高（可識別50～70 bp的拷貝數變異）的特點[4]。該技術自誕生后已在基因拷貝數分析、異倍體檢測、產前診斷、突變缺失、單核苷酸多態性等多方面檢測研究中廣泛應用[25]。早在2009年國外就將MLPA與FISH及染色體核型分析檢測結果進行了比對，結果顯示MLPA檢測靈敏度、特異度可達100%，證實了MLPA用于染色體非整倍體檢測的有效性[26]。隨著MLPA技術的推廣運用，研究者逐漸發現MLPA應用于SA組織染色體異常的檢測具有一定的臨床應用價值，但也存在一定的局限性，如無法檢測多倍體、平衡易位以及無法對探針不涉及的未知染色體變異進行檢測等。MLPA技術存在自身的優勢與劣勢，應從實驗室自身具體情況出發，選擇合適的檢測分析方法，以期為患者提供更全面的遺傳咨詢信息。

2.5 染色體微芯片技術

CMA技術是近年來發展起來的高通量檢測技術，主要包括兩大類：微陣列比較基因組雜交技術（array comparative genomic hybridization，array-CGH）和單核苷酸多態性微陣列技術（single nucleotide polymorphism array，SNP-array）。

比較基因組雜交技術（comparative genomic hybridization，CGH）是自1992年后發展起來的一種分子細胞遺傳學技術，其基本原理將待測DNA和對照DNA分別標記不同的熒光素后與正常染色體雜交，經熒光數字成像系統掃描后通過比較兩種熒光素的相對濃度來檢測兩種DNA拷貝數的變化。CGH 檢測分辨率約為 3～10Mb[27]，與核型分析技術檢測分辨率相當，為了提高分辨率，研究者將微陣列技術引入，誕生了array-CGH技術。Array-CGH技術通量高，分辨率可達200 kb，并且能一次性掃描全基因組拷貝數變異（copy number variation，CNV），尤其是對全基因組微小染色體異常的檢測更是將染色體病的診斷提高到基因水平。臨床已將該技術應用于發育遲緩/智障、自閉癥、先天畸形等方面的病因篩查[28]。而 Gao J等[29]的研究則證實了該技術用于流產病因分析的可靠性和適用性，但該研究結果也表明array-CGH技術并不適用于多倍體的檢測。同時，基于其檢測原理，array-CGH技術對于芯片探針無法覆蓋的染色體區段將無法檢測，這將限制了發現新發疾病或突變的可能；對于單親二倍體（uniparental disomy，UPD）的檢測也受到限制。Agilent公司的芯片是目前array-CGH技術的主流平臺。

與array-CGH技術檢測原理不同，SNP-array技術只需將雜交后的待測樣本與一整套正常基因組對照資料進行對比即可獲得診斷。除了array-CGH技術的檢測范圍以外，SNP-array技術還能夠檢出核型分析、MLPA、FISH及array-CGH都無能為力的雜合性缺失（Loss of Heterozygosity，LOH）和UPD[30]。UPD與完全性葡萄胎相關，也是導致流產的原因之一[31]。雖然SNP-array技術具有獨一無二的檢測能力，但高昂的成本阻礙了該技術在臨床上的普及，目前只有有限的臨床科室在使用該技術。與array-CGH技術局限相同的是，SNP-array技術也不能檢測未知的突變或疾病。此外，SNP-array技術對于染色體的平衡易位、倒位、多倍體（除三倍體外）等也無法檢測。Affymetrix公司的芯片是目前SNP-array技術的主流平臺。

CMA技術具備其他檢測技術所不能達到的檢測能力，且對樣本要求低，對于流產物樣本常為陳舊標本尤為適宜。但其高分辨率也是一把“雙刃劍”，雖然能為流產病因分析提供全面的信息，但檢測出的小片段CNV常常也給臨床報告解讀醫生帶來困擾，尤其是對于現有數據庫中尚未明確的CNV的解讀需要更加謹慎。

2.6 下一代測序技術

自2005年以來，NGS從生物醫學研究領域逐漸應用到臨床診斷，將臨床分子診斷推進一個新高潮。NGS技術的基本原理是基于PCR擴增，將帶有標志物的堿基加入反應中，根據堿基互補原則，堿基結合DNA模板時采集生物標志物發出的信號進行序列信息的讀取，以達到測序的目的。根據采集信號的不同，目前臨床上常用的NGS平臺分別有以采集光信號為代表的Illumina公司的Solexa測序平臺及以采集H+流信號為主Life Technologies公司的 Ion torrent半導體測序平臺[32]。NGS最早用于臨床染色體異常檢測為無創產前診斷（noninvasive prenatal testing，NIPT），其檢測的準確性及可靠性已得到大規模臨床應用數據的支持[33，34]。隨著NGS技術的進步和測序成本的大幅下降，NGS在臨床各領域的應用如雨后春筍般普及開來。受益于其成本的下降及操作的簡便，NGS也在流產物檢測中得到應用。Shen等[35]采用436例早期自然流產的樣本評估array-CGH技術和NGS技術流產物檢測的應用效能，結果顯示array-CGH和NGS檢出率高，能夠檢測出傳統核型分析漏檢的對于復發性流產夫婦遺傳咨詢尤為重要的染色體的微重復和微缺失。郭依琳等[36]的研究結果也證明了NGS技術用于流產物遺傳學分析的價值。與前面介紹的幾項技術相比，NGS除了具有高分辨率、高敏感性和準確性、自動化程度高、成本低、對樣本要求低、能夠一次性掃面全基因組等優點以外，還可以發現CMA平臺未能覆蓋的CNV以及尚未有報道的新發突變，這對于流產的病因分析，尤其是反復性流產夫婦的遺傳咨詢尤為重要。盡管NGS在流產物檢測上有眾多的優勢，該技術平臺也存在自身的局限，如NGS不能檢出UPD及多倍體異常，而且NGS分辨較CMA平臺更高，因此，在臨床應用時應該了解技術平臺的局限性，為患者的遺傳咨詢提供準確信息。

3 小結與展望

染色體異常為SA的主要病因。目前臨床上用于染色體異常檢測的分子生物學技術已經大幅度提高染色體異常檢出率，但各具局限性。已有研究將NGS和QF-PCR技術進行聯合檢測，有效地檢出了染色體多倍體。這提示我們在日常臨床工作中，應了解各項檢測技術的優缺點，通過聯合檢測手段，在現有技術基礎上增加染色體異常檢出率，為后續遺傳咨詢提供更多更準確的信息。