東莞市2017-2018年兒童下呼吸道感染病例監測結果

孫志豪 張榮華 鐘超珍

呼吸系統感染是兒科的常見疾病，是發展中國家乃至發達國家低年齡段人口的重要死因之一，越來越受到公眾的關注[1-3]。在我國珠三角地區如廣州、深圳等城市的流行病學研究中顯示，社區獲得性肺炎（community acquire pneumonia，CAP）往往伴隨多種呼吸道病原體感染[4-5]。東莞市位于珠江三角洲地區，地理上屬于亞熱帶季風氣候，雨熱同期，受本地獨特氣候特點的影響，呼吸系統疾病的流行有其獨特的規律。兒童下呼吸道感染的病原體的構成復雜，臨床癥狀缺乏特異性，傳統的病原學診斷常通過病原體分離培養實現，該方法缺耗費時間長，且鑒定數量有限，難以滿足臨床診斷需求[6]。而液相芯片技術的出現，恰好彌補了這些缺陷，有助于快速確診、控制病情。液相芯片，也稱為微球懸浮芯片，是基于美國Luminex公司開發的新型生物芯片技術平臺，具有操作簡單，雜交動力學快，應用靈活等優點[7-10]。本研究采用基于液相芯片平臺的核酸檢測技術，對東莞市婦幼保健院住院患兒下呼吸道感染標本進行13種常見呼吸道病原體的核酸檢測，并對結果進行分析，嘗試在多重病原體、較大樣本量的維度上研究兒童呼吸系統感染的流行規律，為兒童呼吸系統感染性病例的預防和控制提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究的研究對象選取自2017年11月至2018年10月在東莞市婦幼保健院因下呼吸道感染住院的2 850例患兒。在對患兒進行呼吸道標本采集前均征得患兒家長/監護人知情同意并通過患兒所在醫院倫理委員會批準。診斷標準依據《兒童社區獲得性肺炎管理指南（2013修訂）》[11-12]，住院患兒入組符合下呼吸道感染標準：出現咳嗽、痰粘稠，肺部出現濕羅音，并有下列3種情況之一：①發熱；②白細胞總數和（或）嗜中性粒細胞比例增高；③X線顯示肺部有炎性浸潤性病變。排除標準：非感染性原因如肺栓塞、心力衰竭、肺水腫、肺癌等所致的下呼吸道的胸片改變。在2 850例患兒中，男性1 781例（62.49%），女性 1 069例（37.51%）；0～≤6月齡患兒 1 051例（36.90%），＞6～≤12月齡患兒 554例（19.40%），＞1～≤3周歲患兒956例（33.50%），＞3～≤7周歲患兒228例（8.00%），＞7周歲以上患兒61例（2.10%），中位數年齡為10個月。

1.2 方法

1.2.1 標本采集

在患兒入院當天采集咽拭子置于2 mL樣品保存液中，4℃保存并在24 h內送至實驗室進行檢測，標本運輸過程均保持4℃。

1.2.2 試劑和儀器

試劑：核酸提取試劑盒采購自廣州美基生物科技有限公司，PCR試劑采購自中山大學達安基因股份有限公司，液相芯片檢測試劑耗材采購自美國Luminex公司。

儀器：PCR儀采購自安杰思醫學科技有限公司，型號為AGT9601。液相芯片檢測儀采購自美國Luminex公司，型號為Magpix50。

1.2.3 引物與探針

1.2.3.1 多重PCR引物設計 由于流感病毒A型、流感病毒B型、副流感病毒、人偏肺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒是RNA病毒，因此這6種RNA病毒的多重反轉錄PCR設計在一管中反應，這6種病毒，以及用于內參的人的GAPDH基因對應的PCR引物序列見表1。而博卡病毒、腺病毒、肺炎支原體、卡塔布蘭漢菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、百日咳菌則是基于DNA水平檢測，因此無需做反轉錄，只需要基于PCR擴增即可，這7種基于DNA檢測的病原體的多重PCR引物引物序列見表2。

所有的反向引物R引物的5′端均用生物素進行標記。

1.2.3.2 探針設計 針對8種病毒、5種細菌、1種支原體和1個人的內參基因一共設計了15條探針，探針序列如表3。

所有探針的5′端均用連續18個碳原子加上氨基修飾。

表1 檢測RNA病毒的多重PCR引物序列Table1 Detection of RNA virus by multiplex PCR primer sequence

表2 基于DNA檢測的病原體的多重PCR引物序列Table2 Multiplex PCR primer sequences of pathogens based on DNA detection

表3 探針序列Table3 Probe sequence

1.2.4 核酸提取及擴增

待檢樣本送至實驗室后使用核酸提取試劑對樣本進行DNA和RNA的提取。完成核酸提取后，取出-20℃保存的13項呼吸道病原體核酸檢測試劑盒（RNA/DNA）擴增試劑，解凍、分裝加入PCR八聯管。將待檢核酸與擴增試劑混合后進行PCR擴增。按照PCR擴增試劑盒的操作說明書，根據病原體核酸種類不同，使用不同的擴增程序進行擴增，并選擇GAPDH作為內對照進行質控。

檢測DNA的病原體為：人博卡病毒（human Bocavirus，hBoV）、腺病毒（adenovirus，AdV）、流感嗜血桿菌（haemophilus influenza，Hi）、肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，MP）、卡他莫拉菌（morella catarrhalis，MC）、肺炎鏈球菌（streptococcus pneumonia，SP）和百日咳桿菌（bordetella pertussis.BP）；檢測RNA的病原體為：呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）、流感病毒A型（Influenza A virus，FluA）、流感病毒B型（Influenza B virus，FluB）、人偏肺病毒（human partial pulmonary virus，hMPV）、副流感病毒（parainfluenza virus，PIV）和鼻病毒（human rhinovirus，HRV）。

設置如下程序進行PCR擴增：①檢測DNA病原的擴增程序為：37℃10 min，反應1個循環；95℃10 min，反應 1 個循環；95℃ 30 s；52℃ 1 min；65℃1 min；95℃ 30 s，反應 30 個循環；95℃ 30 s；65℃45 s；72℃ 45 s；95℃ 30 s，反應 25 個循環；72℃ 5 min，反應1個循環；12℃保持至反應管從儀器上移走。②檢測RNA病原的擴增體系為：50℃30 min，反應1個循環；94℃ 2 min，反應1個循環；94℃ 30 s；52℃ 45 s；72℃ 30 s；94℃ 30 s，反應 30 個循環；94℃ 30 s；65℃ 30 s；72℃ 30 s；94℃ 30 s，反應 25個循環；72℃5 min，反應1個循環；12℃保持至反應管從儀器上移走。擴增結束后，取出并檢查樣本標記是否依舊清晰，管內試劑是否揮發，已擴增樣本盡快進行雜交檢測，如需保存需放置4℃冰箱。

1.2.5 核酸雜交

開啟Luminex Magpix液相芯片檢測平臺，進行儀器和軟件設置，建立檢測程序；將擴增產物分別加入核酸雜交試劑中，在PCR儀上進行雜交顯色反應；顯色結束后將樣品放入Magpix96孔板加熱模塊中，運行已保存的待檢測批次，進行檢測，得到結果。

1.3 統計學分析

數據統計通過SPSS 22.0軟件完成。計數資料采用例數和百分比表示，組間采用t檢驗、χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病原學檢測結果

在2 850例患兒的標本中檢測出病原體陽性的例數為1 720例（60.35%），檢出2種及2種以上病原體陽性的例數為533例（18.70%）；在1 720例病原學陽性患兒中，檢出1種病原體陽性例數為1 187例（41.65%），檢出2種病原體陽性例數為440例（15.44%），檢出3種病原體陽性例數為85例（2.98%），檢出4種病原體陽性例數為8例（0.28%）。在13種病原體中，檢出率最高的前3種分別是RSV 661例（23.19%），SP 629例（22.07%）和Hi 282例（9.89%）；而混合感染率排名前5的病原體分別是 MC（98/119，82.35%）、HRV（21/34，61.76%），Hi（171/282，60.64%），hMPV（44/75，58.67%）和SP（357/629，56.76%）。具體檢測情況詳見表4至表6。

表4 2 850例患兒下吸呼吸道感染標本病原體檢測結果Table4 Detection of pathogens in 2 850 children with lower respiratory tract infections

表5 2 850例患兒下吸呼吸道感染標本病原體檢測結果Table5 Detection of pathogens in 2 850 children with lower respiratory tract infections

表6 2 850例患兒下吸呼吸道感染標本病原體檢測結果Table6 Detection of pathogens in 2 850 children with lower respiratory tract infections

2.2 不同年齡組的病原體檢出情況

通過比較各年齡別組間（0～≤6月齡組、＞6～≤12月齡組、＞1～≤3周歲組、＞3～≤7周歲組和＞7周歲以上組）的檢出率發現，BP、SP、Hi、MP、RSV、AdV、hBoV、HRV和PIV的檢出率在組間存在差異。其中低年齡段患兒中最常見的呼吸道病原體是RSV，在3周歲以下的3個年齡組檢出率均在20%以上，而3周歲以上患兒中檢出率不足2%；SP在0～≤6月齡組僅檢出72例（6.85%），隨著年齡的增長呈現上升的趨勢；MP的檢出率也隨著年齡的增長逐漸上升；Hi在中間的3個年齡組（＞6～≤12月齡組、＞1～≤3周歲組和＞3～≤7周歲組）檢出率均超過10%，而其他2組的檢出率較低。13種呼吸道病原體在各年齡組中的檢出率詳見表7。

表7 不同年齡組下呼吸道感染患兒的病原體檢測結果Table7 Pathogen detection results of children with lower respiratory tract infection in different age groups

2.3 各病原體檢出率的季節變化

SP的檢出率在4月份開始升高，5-10月份間均維持在較高水平（＞20%）；RSV檢出率在3月份有1個次高峰，4-6月份有所下降，而后在7月份開始上升并在9月份達到最高峰，并在達到高峰之后迅速下降；Hi的檢出率亦呈現明顯的季節性，在2月份開始逐漸上升并在5月份達到高峰，之后緩慢下降在10月份之后維持一個較低的水平；MC和MP的檢出高峰期均是10-11月份；BP、HRV、hBoV、PIV、FluA、FluB、hMPV和AdV全年各月的檢出率均低于10%，其中PIV的檢出高峰期是4-6月份，hMPV的檢出高峰期是4-5月份。總的來說兒童下呼吸道感染病原體春季檢出率春季較其它季節低，具體情況詳見圖1。

3 討論

下呼吸道感染是兒童時期的常見病，世界范圍內每年5歲以下兒童發生肺炎約1.6億，中國約0.21億[11-13]。據世界衛生組織統計，在5歲以下兒童死亡原因中，下呼吸道感染占第二位[11-13]。液相芯片技術是近年來發展迅速的一種高通量、高靈敏度、高靈活性的檢測平臺，廣泛運用于臨床診斷的各個領域，包括激素水平測定、核酸檢測和免疫學分析等[5-10]。本研究的檢測均是基于Luminex Magpix液相芯片平臺，在提高檢測通量的同時也確保了檢測結果的穩定性和可重復性。

本研究的監測時間歷時1年，在2 850例社區活動性肺炎患兒臨床標本中發現了1 720份（60.35%）病原學陽性標本，其中呼吸道合胞病毒（23.19%）、肺炎鏈球菌（22.07%）和流感嗜血桿菌（9.89%）是這1年間東莞市兒童社區活動性肺炎病例中檢出率最高的3種病原體。呼吸道合胞病毒的檢出率在13種病原體中最高，這提示臨床醫師在臨床上不應忽視病毒性肺炎的存在，在進行診斷的時候除了參考常規的體格檢查、血常規和X線檢查之外，應更加重視病原學實驗室檢測的結果，科學合理地使用抗生素，避免對單一的病毒性肺炎病例使用抗生素[3]。混合感染率最高的前5位病原體在嚴格意義上講均是條件致病微生物（卡他莫拉菌、鼻病毒，流感嗜血桿菌，人偏肺病毒和肺炎鏈球菌），通常寄生于正常人體呼吸道粘膜中，在機體免疫力下降或原發感染出現之后引起繼發性感染，在臨床上檢出此類病原體的時候應

注意有無其他病原體的合并感染，避免漏診了原發感染病原體而延誤病情[2，7，14-18]。

圖1 2 850例患兒標本中13種呼吸道病原體檢出率的季節分布特點Figure1 The seasonal distribution of 13 respiratory pathogens in 2 850 children

在對各病原體的檢出率就行年齡組間比較之后發現有9種病原體的組間檢出率存在差異，其中百日咳桿菌、副流感病毒和呼吸道合胞病毒隨著年齡組的增長，檢出率逐步下降，呈現比較明顯的下降趨勢。這一結果與國內過往其他研究的結果[19-22]類似，均是從低年齡組向高年齡組逐漸下降。這可能與低年齡組嬰兒的自身免疫力較低有關。例如，目前的免疫規劃要求新生嬰兒應在6月內完成百白破疫苗的接種，而這段時間恰好是新生兒對百日咳桿菌抵抗力最低的時段，離開了母體的保護，主動免疫屏障尚未形成，這都可以解釋低年齡組相對較高的百日咳桿菌檢出率。而肺炎鏈球菌、肺炎支原體的檢出率與上述3種病原體恰好相反，隨著年齡的增長，檢出率呈現逐漸上升的趨勢。這一趨勢與國內其他同類研究的結果[20-23]類似，這可能與機體呼吸道正常菌群的建立過程有關。嬰兒期的呼吸道生態位特異性細菌群落以葡萄球菌屬為優勢種群，隨著年齡的增長葡萄球菌屬逐漸被嗜血桿菌屬和鏈球菌屬所替代，這也許可以解釋肺炎鏈球菌在不同年齡組之間的檢出率差異。但肺炎支原體檢出率的組間差異仍然需要進一步的研究。

13種病原體中檢出率季節性變化最明顯的是呼吸道合胞病毒，呈現非常明顯的雙峰曲線，2個檢出率高峰分別在3月份和9月份，造成這個月間差異的原因可能是與東莞本地典型的亞熱帶季風氣候相關，3月份陰冷潮濕，9月份高溫多雨，這種高濕度的環境可能對呼吸道合胞病毒的定植入侵有一定的幫助。此外，副流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒和流感嗜血桿菌檢出率較高的月份是在4-6月份，而百日咳桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎支原體和卡他莫拉菌檢出率較高的月份是在10-12月份，這一結果提示在日常的監測工作中可以根據不同的時間段有的放矢地關注特定的病原體，提高臨床診斷過程的效率。

與傳統的病原學分離培養及核酸分離培養檢測技術相比，基于液相芯片法的流式PCR技術檢測效率更高，通量更大，如果能夠大規模運用于社區獲得性肺炎監測項目，可大大減少監測哨點醫院的工作量。但是該檢測技術也存在短板，僅僅是對病原體的核酸進行檢測，結果的特異性不如傳統的病原學分離培養方法[8-10]。這2種檢測技術互有優劣，建議在實際監測工作中串聯使用，用液相芯片法進行病原學初篩，然后對陽性標本進行病原學分離培養，可有效提高監測系統的效率，更好地指導臨床工作。