龍葵堿聯合KLF16基因對膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響及其機制研究

趙舒楊 雷艷杰 馬世杰 高明

膠質瘤是腦中樞神經系統中常見的惡性腫瘤，其中膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是惡性程度最高、最常見的亞型，5年生存率低于5%[1]。目前，手術摘除、局部照射和常規化療等治療手段雖取得了一定的進展，但是膠質瘤患者的總體生存率仍無明顯改善[2]。放療及化療產生的嚴重副作用及并發癥，嚴重影響患者預后，因此傳統中藥聯合靶向基因治療的方式越來越受到人們的關注。龍葵堿廣泛存在于龍葵全草、馬鈴薯、番茄等茄科植物中，具有抗病毒、抗炎和抗腫瘤等作用[3]。相關的研究發現，龍葵堿可抑制肝癌、胰腺癌、乳腺癌等多種類型腫瘤細胞的生長[4-6]。Krüppel樣轉錄因子 16（Krüppel-like transcription factor 16，KLF16）是 Krüppel樣轉錄因子家族成員之一，參與細胞周期和啟動子依賴性方式的轉錄調節[7]。KLF16在肺腺癌中通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡發揮腫瘤抑制作用[8]。轉錄因子KLF16可通過細胞色素p450酶抑制子宮內膜生理和代謝[9]。據報道，KLF16通過調節肝配蛋白受體A5（recombinant ephrin A5，EphA5）的表達影響視網膜神經節細胞中神經突向外生長[10]。以上研究表明龍葵堿和KLF16在抑制腫瘤生長，誘導腫瘤細胞凋亡中，二者具有一致性。因此本實驗探討龍葵堿聯合KLF16基因對膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響，并初步探討其作用機制，以期為膠質瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

龍葵堿（美國Sigma公司），質量分數＞95%，以二甲基亞砜稀釋至1 mg/mL，經0.22 μm濾膜過濾除菌，在-20℃條件下儲存，使用時以DMEM培養基稀釋到所用濃度。人膠質母細胞瘤U87細胞（中國科學院上海細胞庫）；DMEM培養基、胎牛血清（美國HyClone公司）；胰蛋白酶、青鏈霉素（杭州四季青生物工程材料有限公司）；二甲基亞砜、MTT試劑（美國Sigma公司）；轉染試劑（美國賽默飛世爾公司）；特異性KLF16siRNA和陰性對照siRNA Control（廣州市銳博生物科技有限公司）；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（日本TaKaRa公司）；Trizol試劑（碧云天生物技術研究所）；逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix實時熒光定量PCR試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；兔抗人KLF16抗體、兔抗人Ki-67抗體、兔抗人PCNA抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Bcl-2抗體及山羊抗兔IgG（美國Abcam公司）。

1.2 細胞培養

人膠質母細胞瘤U87細胞培養在含10%胎牛血清、含100 U/L青鏈霉素的DMEM培養基中，置入飽和濕度、體積分數為5%CO2、37℃恒溫培養箱中，根據細胞生長狀態及時更換新鮮培養液，每隔1～2 d用胰蛋白酶傳代1次。取對數增殖期的U87細胞用于實驗。

1.3 特異性KLF16siRNA轉染細胞

取對數生長期的U87細胞接種到6孔板中，接種密度為5×105個/孔，置于37℃培養箱繼續培養，待細胞匯合密度達60%時，按照轉染試劑說明說進行轉染實驗，其中轉染特異性KLF16siRNA的U87細胞設置為si-KLF16組，轉染陰性對照siRNA Control的U87細胞設置為si-NC組，轉染后各組U87細胞置37℃培養箱繼續培養。

1.4 qRT-PCR檢測U87細胞中KLF16mRNA表達水平

轉染48 h后分別收集si-NC組和si-KLF16組U87細胞，按照Trizol試劑說明說提取細胞中總RNA，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，以實時熒光定量PCR檢測試劑盒進行擴增，KLF16上游引物：5′-GTGTACCAAGCGGTTCACC-3′；下 游 引物 ：5′-CAGGTCGTCGCAGGAGTTC-3′。內參GAPDH上游引物：5′-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′；下游 引 物：5′-CCAAATCCGTTGACTC-3′。采 用2-ΔΔCt法分析各組細胞中KLF16mRNA相對表達水平。

1.5 Western blot檢測U87細胞中KLF16蛋白表達水平

轉染48 h后，收集si-NC組和si-KLF16組U87細胞，加入RIPA細胞裂解液，于冰上提取細胞中總蛋白，加入上樣緩沖液，加熱變性，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后電轉至PVDF膜上，將膜置5%脫脂奶粉中封閉2 h，分別加入KLF16和GAPDH一抗（KLF16一抗1∶800稀釋，GAPDH一抗1∶1 000稀釋），4℃過夜雜交，再加入二抗（1∶3 000稀釋），室溫雜交2 h。采用ECL法顯色，在凝膠成像儀中拍照，采用Image J軟件分析各條帶灰度值，以KLF16條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示KLF16蛋白相對表達水平。

1.6 龍葵堿對U87細胞的毒性實驗

對數生長期si-NC組和si-KLF16組U87細胞接種到96孔板中，調整細胞密度為5×105個/孔，分別向si-NC組和si-KLF16組U87細胞加入0、2.5、5、10、20、30 μg/μL的龍葵堿，每組3個復孔，分別孵育48 h，向每孔細胞中加入100 μL MTT溶液，37℃常規培養箱中繼續培養4 h，除去舊培養液，再加入150 μL二甲基亞砜，混勻后，室溫振蕩反應10 min，待紫色結晶完全溶解，在全自動酶標儀上測定450 nm波長處光密度值（optical density，OD值），計算細胞增殖抑制率，增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。選取增殖抑制率接近50%的龍葵堿濃度即半數抑制濃度（half maximal inhibitory concertration，IC50）為實驗加藥標準濃度，并將U87細胞設成 4組：si-NC 組、si-KLF16組、si-NC+Sol組和si-KLF16+Sol組。

1.7 噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）法檢測細胞增殖能力

將對數生長期的si-NC組和si-KLF16組U87細胞接種到6孔板中，調整細胞密度為5×105個/孔，37℃培養箱過夜培養，待細胞覆蓋率達60%時，分別向si-NC+Sol組和si-KLF16+Sol組U87細胞中加入標準濃度（20 μg/μL）的龍葵堿，37℃培養箱處理48 h，向各組U87細胞中加入MTT溶液100 μL，繼續孵育4 h，再加入150 μL二甲基亞砜，振蕩反應10 min，酶標儀測定450 nm處的OD值，計算各組細胞增殖率，增殖率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

si-NC組、si-KLF16組、si-NC+Sol組和si-KLF16+Sol組U87細胞按照1.7處理48 h，收集各組細胞，PBS洗滌細胞3次，用1×Binding Buffer結合緩沖液重懸細胞，向細胞懸液中分別加入 AnnexinⅤ-FITC 和 PI各 5 μL，混勻后室溫避光反應20 min，立即上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.9 Western blot檢測各組U87細胞中增殖細胞核抗原（ProliferatingCellNuclearAntigen，PCNA）、Ki-67、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 Associated X Protein，Bax）和 B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）蛋白表達水平。

si-NC組、si-KLF16組、si-NC+Sol組和si-KLF16+Sol組U87細胞按照1.7處理48 h，收集并提取細胞中總蛋白，檢測各組細胞中Ki-67、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白相對表達水平，方法同1.5。

1.10 統計學分析

使用SPSS 21.0軟件進行數據統計分析，計量資料均以表示，2組數據間比較采用t檢測分析，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩組間差異比較采用SNK-q檢驗分析，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1KLF16基因轉染效果檢測

分別將特異性KLF16siRNA和陰性對照siRNA Control轉染膠質瘤U87細胞，48 h后qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，si-KLF16組U87細胞中KLF16mRNA和蛋白表達水平顯著低于si-NC組（t1=12.277，t2=14.742，P＜0.05），見圖1和表1。

圖1 Western blot檢測si-NC組和si-KLF16組U87細胞中KLF16蛋白表達情況Figure1 Western blot analysis of KLF16 protein expression in si-NC group and si-KLF16 group U87 cells

表1 轉染后對U87細胞中KLF16表達的影響（±s）Table1 Effect of KLF16 expression on U87 cells after transfection（±s）

表1 轉染后對U87細胞中KLF16表達的影響（±s）Table1 Effect of KLF16 expression on U87 cells after transfection（±s）

與si-NC組比，aP＜0.05。

組別si-NC si-KLF16 KLF16 mRNA 1.00±0.10 0.26±0.03a KLF16蛋白0.33±0.03 0.07±0.01a

2.2 龍葵堿對膠質瘤U87細胞的細胞毒性作用

本實驗選擇不同濃度（2.5、5、10、20、30 μg/μL）的龍葵堿作用于si-NC組和si-KLF16組U87細胞48 h，MTT法測定細胞增殖抑制率，結果顯示（見表2），龍葵堿呈濃度依賴性的抑制si-NC組和si-KLF16組U87細胞增殖（P＜0.05），且濃度為20 μg/μL的龍葵堿作用于si-NC組和si-KLF16組48 h時細胞增殖抑制率分別為（48.84±4.88）%和（51.34±5.13）%，增殖抑制率均在50%左右，因此選取20 μg/μL的龍葵堿作為后續實驗加藥濃度。

表2 不同濃度的龍葵堿作用于膠質瘤細胞48 h后細胞增殖抑制率（±s）Table2 Inhibition rate of cell proliferation after different concentrations of solanine applied to glioma cells for 48 h（±s）

表2 不同濃度的龍葵堿作用于膠質瘤細胞48 h后細胞增殖抑制率（±s）Table2 Inhibition rate of cell proliferation after different concentrations of solanine applied to glioma cells for 48 h（±s）

與0 μg/μL龍葵堿組比，aP＜0.05。

龍葵堿濃度（μg/μL）0 2.5 5 10 20 30 F值P值增殖抑制率（%）si-NC組0.00 0.68±0.45 14.72±1.47a 32.18±3.22a 48.84±4.88a 78.34±7.84a 172.082＜0.001 si-KLF16組0.00 0.72±0.61 15.79±1.59a 35.05±3.50a 51.34±5.13a 81.36±8.14a 169.595＜0.001

2.3 各處理組對膠質瘤U87細胞增殖的影響

MTT實驗分析結果顯示，與si-NC組相比，si-KLF16組、si-NC+Sol組和si-KLF16+Sol組 U87細胞增殖率明顯降低（P＜0.05），與si-KLF16組和si-NC+Sol組相比，si-KLF16+Sol組U87細胞增殖率顯著降低（P＜0.05），見表3。

2.4 各處理組對膠質瘤U87細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-KLF16組、si-NC+Sol組和si-KLF16+Sol組 U87細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），與si-KLF16組和si-NC+Sol組相比，si-KLF16+Sol組U87細胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖2和表4。

2.5 各組U87細胞中Ki-67、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表達情況

圖2 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況Figure2 Flow cytometry to detect apoptosis

表3 各處理組U87細胞增殖能力（±s）Table3 U87 cell proliferation ability of each treatment group（x ± s）

表3 各處理組U87細胞增殖能力（±s）Table3 U87 cell proliferation ability of each treatment group（x ± s）

與 si-NC 組比，aP＜0.05；與si-KLF16組比，bP＜0.05；與si-NC+Sol組比，cP＜0.05。

組別si-NC si-KLF16 si-NC+Sol si-KLF16+Sol F值P值增殖率（%）100 48.58±2.19a 51.09±2.21a 86.79±4.24abc 287.496＜0.001

表4 各處理組U87細胞凋亡率比較（±s）Table4 Comparison of Apoptosis Rates of U87 Cells in Each Treatment Group（±s）

表4 各處理組U87細胞凋亡率比較（±s）Table4 Comparison of Apoptosis Rates of U87 Cells in Each Treatment Group（±s）

與 si-NC 組比，aP＜0.05；與si-KLF16組比，bP＜0.05；與 si-NC+Sol組比，cP＜0.05。

組別si-NC si-KLF16 si-NC+Sol si-KLF16+Sol F值P值凋亡率（%）1.97±0.55 26.66±4.29a 19.24±4.36a 58.79±5.68abc 97.001＜0.001

圖3 Western blot檢測各組U87細胞中Ki-67、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白水平Figure3 Western blot analysis of Ki-67，PCNA，Bax and Bcl-2 protein levels in U87 cells

表5 各組U87細胞中Ki-67、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較（±s）Table5 Comparison of Ki-67，PCNA，Bax and Bcl-2 protein expression levels in U87 cells of each group（±s）

表5 各組U87細胞中Ki-67、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較（±s）Table5 Comparison of Ki-67，PCNA，Bax and Bcl-2 protein expression levels in U87 cells of each group（±s）

與si-NC組比，aP＜0.05；與si-KLF16組比，bP＜0.05；與si-NC+Sol組比，cP＜0.05。

Bcl-2 0.85±0.08 0.53±0.05a 0.57±0.06a 0.20±0.03abc 63.485＜0.001組別si-NC si-KLF16 si-NC+Sol si-KLF16+Sol F值P值Ki-67 0.83±0.10 0.58±0.06a 0.60±0.06a 0.31±0.03abc 30.011＜0.001 PCNA 0.78±0.08 0.49±0.05a 0.49±0.05a 0.24±0.03abc 47.545＜0.001 Bax 0.47±0.05 0.86±0.09a 0.81±0.08a 1.21±0.11abc 37.811＜0.001

Western blot檢測各組膠質瘤U87細胞中Ki-67、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表達情況，結果顯示，與si-NC組相比，si-KLF16組、si-NC+Sol組和si-KLF16+Sol組U87細胞中Ki-67、PCNA和Bcl-2蛋白表達下調（P＜0.05），Bax蛋白表達上調（P＜0.05）；與 si-KLF16組和 si-NC+Sol組相比，si-KLF16+Sol組U87細胞中Ki-67、PCNA和Bcl-2蛋白表達下調（P＜0.05），Bax蛋白表達上調（P＜0.05）。見圖3和表5。

3 討論

膠質瘤具有發病率高、復發率高、死亡率高、治愈率低的特點，是目前成人中最常見的原發性腦腫瘤[11]。傳統的治療策略通常將腫瘤切除與放療和化療相結合，但治療效果往往不能令人滿意[12]。與此同時，放療及化療產生的多種毒副作用在很大程度上限制了膠質瘤的療效。因此，探索更高效更合理的聯合治療手段對膠質瘤的治療具有非常重要的意義。目前備受青睞的分子靶向治療和中藥聯合使用具有良好的應用前景[13]。KLF16在肺腺癌中發揮抑制基因的作用，其表達量的高低與患者生存率密切相關[8]。本實驗將特異性KLF16siRNA轉染人膠質瘤U87細胞中，qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示轉染KLF16siRNA后U87細胞中KLF16mRNA和蛋白表達水平均明顯降低，表明轉染KLF16siRNA能夠有效沉默U87細胞中KLF16。MTT實驗和流式細胞儀檢測結果顯示，沉默KLF16基因后U87細胞增殖明顯受到抑制，細胞凋亡增加。這與近期Chen等[14]人的報道一致，該報道指出KLF16可通過靶向線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）抑制人腦膠質瘤細胞增殖和致腫瘤。另有研究表明，KLF16可抑制胰腺癌細胞生長和轉化，阻滯細胞周期于S期，誘導細胞凋亡[14]。Ma等[16]人研究顯示，KLF16通過調節 p21和CDK4促進胃癌細胞的增殖。提示KLF16作為一種腫瘤細胞調控因子，參與腫瘤細胞的生長、增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學過程。

相關研究顯示，龍葵堿不僅具有抗炎作用還具有抗腫瘤活性[17-18]。近期郭玲等人[19]研究指出，龍葵堿能夠呈濃度依賴性的抑制人膠質瘤U251細胞增殖、侵襲和遷移，并誘導細胞凋亡。本研究通過預實驗結合郭玲等人的研究探索出龍葵堿對膠質瘤U87細胞的有效作用濃度，并將龍葵堿濃度分別配置成2.5、5、10、20、30 μg/μL作用于沉默KLF16或陰性對照組U87細胞，MTT實驗檢測龍葵堿對U87細胞毒性作用，并篩選出濃度為20 μg/μL龍葵堿為后續實驗加藥濃度。并且MTT實驗和流式細胞儀檢測結果發現，20 μg/μL的龍葵堿能夠抑制U87細胞增殖，誘導細胞凋亡。為進一步探究二者聯合使用的協同作用效果，本實驗將沉默KLF16和20 μg/μL的龍葵堿聯合作用U87細胞，結果發現，二者聯合作用對U87細胞增殖抑制及凋亡誘導作用更強。本實驗通過Western blot檢測各處理組U87細胞中Ki-67、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白水平，結果發現龍葵堿或沉默KLF16均可下調U87細胞中Ki-67、PCNA和Bcl-2蛋白表達，上調Bax蛋白表達，且龍葵堿聯合沉默KLF16作用更強。增殖細胞核抗原Ki-67和PCNA是細胞處于增殖狀態的標志物，已廣泛在腫瘤細胞中應用[20-21]。Bcl-2基因是細胞凋亡研究最多基因之一，其具有抑制細胞凋亡的功能。Bax是Bcl-2基因家族中促進細胞凋亡的基因，其過度表達能夠拮抗Bcl-2的保護作用使細胞趨于凋亡[22]。本實驗結果提示龍葵堿聯合KLF16基因對膠質瘤細胞增殖抑制和凋亡誘導作用機制可能與下調Ki-67、PCNA和Bcl-2蛋白表達，上調Bax蛋白表達有關。

綜上，龍葵堿聯合沉默KLF16基因對膠質瘤U87細胞有增殖抑制和凋亡促進作用，并且聯合作用比單獨使用龍葵堿或沉默KLF16基因效果更明顯。本實驗結果提示，中藥和靶向基因治療聯合使用在治療膠質瘤中有可能發揮較好作用，但其適用性和治療效果尚待深入探究。