直腸癌患者外周血中Galectin-3 mRNA、MUC1 mRNA的表達及臨床意義

趙梅 張志宏 郭忠燕 陳營

直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，其發病率僅次于胃癌。目前我國直腸癌的發病率和死亡率逐年上升，且呈年輕化趨勢。手術治療和放化療是直腸癌治療的主要方法，但其臨床效果欠佳，且治療后5年生存率低于50%[1-2]。直腸癌的臨床癥狀和體征較少，早期診斷和治療困難，導致多數直腸癌患者就診時已是中晚期，失去最佳治療時機[3]。目前臨床上多根據直腸癌TNM分期進行預后判斷，然而實踐證實，相同分期患者預后不盡相同，因此尋找有效的直腸癌預后評估指標具有重要意義。國內外研究發現，Galectin-3、MUC1與肺癌、卵巢癌、肝癌等惡性腫瘤的發生和發展有關，但兩者與直腸癌關系的報道較少[4-5]。本研究對直腸癌患者血清中Galectin-3mRNA、MUC1mRNA的表達進行檢測，分析不同臨床特征患者血清Galectin-3mRNA、MUC1mRNA的表達差異，并結合5年隨訪資料探討其表達與直腸癌患者預后的關系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2011年1月至2014年1月本院的123例直腸疾病患者的臨床資料，其中直腸癌患者92例（直腸癌組），男51例，女41例；年齡28～81歲，平均（58.7±11.3）歲；TNM 分期Ⅰ期 12例，Ⅱ期 23例，Ⅲ期37例，Ⅳ期20例；高分化11例，中分化47例，低分化34例；淋巴結轉移45例。納入標準：（1）入選患者均經腸鏡病理學活檢確診；（2）新發現腫瘤患者，尚未接受任何手術、放療、化療等抗腫瘤治療；（3）積極配合治療，依從性好。排除標準：（1）既往腫瘤性疾病患者；（2）心肝腎等臟器功能異常者；（3）合并感染、免疫系統疾病患者；（4）已接受放化療或其他干預治療者；（5）中途轉院及隨訪失聯者。選取同期直腸腺瘤患者31例（直腸腺瘤組），男17例，女14例；年齡31～80歲，平均（59.1±12.7）歲。另選取37例健康志愿者為健康對照組，男20例，女17例；年齡29～81歲，平均（60.7±11.8）歲。各組性別、年齡等資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經醫院倫理委員會審批，研究對象均知情同意。

1.2 標本采集

取3組受試人員外周血4 mL置于潔凈EDTA抗凝管中，3 000 r/min離心10 min后棄去上層血漿，再加入紅細胞裂解液靜置15 min，3 000 r/min離心10 min棄上清，保留沉淀檢測Galectin-3mRNA及MUC1mRNA。本研究所有操作均由專人嚴格按照操作說明書進行。

1.3 檢測方法

1.3.1 儀器與試劑

TRIzol試劑（Invitrogen公司），miScript SYBR Green PCR試劑盒（Promega公司），逆轉錄試劑盒（上海生工生物工程公司），Taq酶（上海生工生物工程公司），低速離心機（Beckman公司），PCR儀（PE公司），電泳及成像系統（UVP公司）。引物根據GenBank中Galectin-3和MUC1基因序列，由上海生工生物工程公司合成，見表1。

1.3.2 總RNA提取

采用TRIzol進行總RNA提取，在260 nm和280 nm下檢測RNA溶液吸光值，選擇純度較高樣品進行后續試驗。

1.3.3 逆轉錄和RT-PCR反應

應用逆轉錄試劑盒合成cDNA，反應體系共20 μL，產物置于-20℃保存備用。應用miScript SYBR Green PCR Kit三步法進行RT-PCR，體系共20 μL，包括 cDNA 5 μL，每種引物 0.5 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 4 μL。擴增條件：95℃預變性 1 min；95℃變性 10 s，62℃退火25 s，70℃延伸10 min，循環45次。結束后采用2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。將標準品與樣品同時進行RT-PCR檢測，繪制標準曲線，計算樣本中Galectin-3mRNA和MUC1mRNA含量，根據本院既往研究結果以mRNA＞103拷貝/mL為陽性。所有標本均重復實驗3次，以β-actin作為內參，陰性對照不加模板。

表1 引物序列Table1 Oligonucleotide sequences of primers

1.4 治療方法

直腸癌患者接受直腸癌根治術治療，術后3周內接受mFOLOFOX6方案藥物化療：奧沙利鉑85 mg/m2，亞葉酸鈣200 mg/m2，2 h內靜脈滴注完成；首日氟尿嘧啶400 mg/m2靜脈推注，第2天及3 d氟尿嘧啶1 200 mg/m2靜脈推注，每2周為1個療程，共完成6個療程化療。化療結束后每3個月以電話或門診方式進行隨訪，統計患者5年生存情況。

1.5 統計學方法

運用SPSS 19.0軟件分析，計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier曲線進行生存分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA表達情況

直腸癌組患者外周血中Galectin-3mRNA表達陽性率為63.0%（58/92），明顯高于健康對照組10.8%（4/37）和直腸腺瘤組25.8%（8/31），差異具有統計學意義（P＜0.01）。直腸癌組患者外周血MUC1mRNA陽性率為53.3%（49/92），明顯高于健康對照組5.4%（2/37）和直腸腺瘤組19.4%（6/31），差異具有統計學意義（P＜0.01），見表2。

表2 3組患者外周血Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA表達情況[n（%）]Table2 Expressions of Galectin-3 mRNA and MUC1 mRNA in 3 groups[n（%）]

2.2 Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA陽性率與直腸癌病理特征的關系

92例直腸癌患者中，Ⅰ+Ⅱ期患者Galectin-3mRNA和MUC1mRNA陽性率為51.4%和37.1%，Ⅲ+Ⅳ期陽性率為70.2%和63.2%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。高、中分化組Galectin-3mRNA和MUC1mRNA陽性率為55.2%和43.1%，低分化組為76.5%和70.6%，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。無淋巴結轉移患者Galectin-3mRNA和MUC1mRNA陽性率為46.8%和36.2%，明顯低于淋巴結轉移患者80.0%和71.1%，差異均具有統計學意義（P＜0.01），見表3。

表3 Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA陽性率與直腸癌病理特征的關系Table3 The relationship between expression of Galectin-3 mRNA，MUC1 mRNA and rectal cancer pathological features

2.3 直腸癌患者生存分析

Kaplan-Meier曲線分析顯示，Galectin-3mRNA和MUC1mRNA陽性患者5年生存率均明顯低于陰性表達患者，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 直腸癌患者Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA表達與5年生存期的關系Figure1 Relationship between Galectin-3 mRNA，MUC1 mRNA and 5-year survival in patients with rectal cancer

2.4 直腸癌患者血清Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA表達的相關性

Spearman分析顯示，直腸癌患者血清Galectin-3mRNA和MUC1mRNA的表達存在顯著相關性（P＜0.05），見表4。

3 討論

直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率較高，我國直腸癌發病率約占全球的1/3。以手術治療為中心的綜合療法是直腸癌的主要治療模式，不同分期的直腸癌患者所采取的治療方案也不完全相同，因此，準確的臨床診斷和分期對治療方案的擬定至關重要[6]。目前直腸癌的臨床診斷和分期主要以MRI（Magnetic Resonance Imaging）和腸鏡超聲為主，其操作較為復雜，而血清生物指標檢測在直腸癌輔助診斷、病情評估方面也具有重要作用，逐漸成為目前醫學研究的熱門課題[7-8]。

表4 直腸癌患者血清Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA表達的相關性Table4 Correlation of serum Galectin-3 mRNA and MUC1 mRNA expression in patients with rectal cancer

Galectin-3為β半乳糖凝集素家族成員，存在于細胞質和細胞核內，通過與胞內糖蛋白、細胞表面因子及胞外基質蛋白的相互作用，減少腫瘤細胞的黏附，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，從而參與到腫瘤的發生、發展的全過程[9-10]。研究發現，Galectin-3可與T細胞表面CD29/CD7結合，誘導T細胞凋亡，阻止T細胞抗Fas抗體引起的凋亡，從而利于腫瘤細胞的免疫逃逸[11]。MUC1為Ⅰ型跨膜糖蛋白，能介導細胞間信號轉導、調節機體免疫等，主要存在于多種組織器官的上皮細胞，呈頂端表達、極性分布。MUC1可與細胞核內Kruppel樣因子4結合，抑制p53的轉錄功能，進而影響p53對損傷DNA的修復作用，導致了腫瘤的發生[12-13]。另有研究顯示，MUC1能夠激活腫瘤壞死因子等受體因子，抑制腫瘤細胞的凋亡[14]。目前國內外研究對Galectin-3、MUC1作為腫瘤特異性標志物已基本認可，但對兩種因子與腫瘤患者預后關系的研究較少[15-16]。

本研究采用RT-PCR技術對外周血中Galectin-3mRNA和MUC1mRNA進行檢測，結果顯示，直腸癌患者Galectin-3mRNA和MUC1mRNA表達陽性率均明顯高于直腸腺瘤組和健康對照組，提示Galectin-3和MUC1的表達與直腸癌的發生有關。另外，研究發現Galectin-3和MUC1mRNA的表達與腫瘤的TNM分期、組織分化程度以及淋巴結轉移有關，TNM分期越高以及淋巴結轉移患者，Galectin-3mRNA和MUC1mRNA陽性發生率也越高，因此，對外周血中Galectin-3mRNA和MUC1mRNA檢測對直腸癌惡性程度評估具有一定參考價值。經5年后隨訪發現，Galectin-3mRNA和MUC1mRNA陽性患者5年生存率均明顯低于陰性患者，提示Galectin-3mRNA和MUC1mRNA的表達與直腸癌患者預后存在相關性，兩者可作為評估患者預后的參考指標。

有研究表明，細胞外Galectin-3可與細胞膜上MUC1結合，導致MUC1極化分布，暴露細胞表面多種黏附因子，促進腫瘤細胞的集聚，增強腫瘤細胞與血管內皮黏附性，從而在腫瘤的侵襲轉移過程中發揮重要作用[17]。本研究發現，直腸癌患者外周血中Galectin-3mRNA和MUC1mRNA的表達呈顯著正相關關系，說明Galectin-3mRNA和MUC1mRNA相互影響，共同參與直腸癌的進展過程。

綜上所述，外周血Galectin-3mRNA、MUC1mRNA表達與直腸癌的發生、發展以及轉移密切相關，Galectin-3mRNA、MUC1mRNA檢測有助于對直腸癌患者預后評估提供參考。