血清MMP-9、蛋白激酶B和Cyt-C聯合檢測在腦出血大鼠模型中的診斷價值

束坤，林濤，劉卓，解利平

腦出血是一種常見的神經科疾病，隨著人類社會的逐漸轉型和發展，腦出血的發病率也在逐年上升[1]。為了防止腦出血給患者帶來更大的負擔和威脅，早期診斷和治療便成為醫學界的重要課題[2]。基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)是一種細胞外基質金屬蛋白酶，對血腦屏障的組成有著重要控制作用；蛋白激酶B(AKT)是一種蘇氨酸激酶，在神經細胞的凋亡中發揮著重要作用；細胞色素-C(Cyt-C)是一種水溶性蛋白，其表達也會對神經基因產生重要的調控作用[3]。本文對腦出血大鼠血清MMP-9、AKT和Cyt-C表達水平進行檢測，旨在分析MMP-9、AKT和Cyt-C在腦出血中的特異表達及對疾病的診斷價值，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：健康雄性SD大鼠30只，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，月齡3～6 (3.8±1.5) 個月，體質量200～250 (220.0±7.9)g。大鼠均養殖在干凈籠中，室溫(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養1周。(2)主要試劑：兔抗人MMP-9、AKT抗體(天根生化科技有限公司)，大鼠抗小鼠Cyt-C抗體(Dako公司)，兔抗小鼠p-AKT抗體(Gibco公司)，小鼠抗大鼠Bcl-2、Bax抗體(Hyclone公司)，ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，PBS緩沖液、TBST緩沖液(上海國藥集團化學試劑有限公司)。(3)儀器設備：離心機、冰箱、光學顯微鏡等(均購自湖南赫西儀器裝備有限公司)。

1.2 實驗方法 2017年1—6月在西電集團醫院進行實驗，所做實驗均獲得醫院倫理委員會批準。將大鼠30只隨機數字表法分為空白組、假手術組和模型組,每組10只。空白組大鼠不做任何處理。模型組大鼠使用10%水合氯醛進行麻醉，俯臥于立體定位儀上進行固定，于大鼠頭頂部進行剃毛，消毒后于正中部位矢狀做一1.5 cm切口，鈍性分離前囟，并使用牙科鉆在前囟后1 mm、右側4 mm處鉆一小孔， 直徑約為1 mm。在距鼠尾末端3 cm處將鼠尾剪斷，采集血液50 μl，其中10 μl注入已鉆好的小孔深5 mm處，2 min之后再以10 μl/min的速度將剩余的40 μl血液注入， 2 min之后退針1.5 mm，再次停留7 min，之后將針緩慢退出，縫合大鼠皮膚，并回籠飼養；假手術組大鼠開顱后插入針頭但不進行血液注射，然后關顱。建模過程中使用恒溫墊使大鼠體溫保持在37.5℃左右。大鼠腦橫斷面中出現明顯血腫，血液無針道反流情況，無蛛網膜下腔出血，無血腫破入腦室視為造模成功，最終建模失敗1只，建模成功9只。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 行為學評價： 在造模結束后第1 d、3 d和5 d采用平衡木評分法[4]和Longa五級評分法[5]對3組大鼠的行為學進行評價。平衡木評分法：能跳上平衡木并在上面行走不會跌倒記0分，在上面行走且跌倒的幾率<50%記為1分；大于50%記為2分；能爬上平衡木，患肢后側不能向前移動記為3分；能坐在平衡木上，但不能行走記4分；將大鼠放在平衡木上會掉下來記5分。分值范圍為0～5分，分值越高則說明大鼠平衡能力受影響越大。Longa五級評分法：無體征記0分；I級動物不能將前肢完全伸直記1分；一側肢體癱瘓，有追尾現象記2分；大鼠不能站立或者打滾記3分；大鼠無自發性活動，并且有意識障礙記4分。分值范圍為0～4分，分值越高則說明大鼠神經行為學能力越差。

1.3.2 神經功能評分： 采用Berderson評分法[6]對3組大鼠第1 d、3 d和5 d神經功能缺損程度進行評價。將大鼠尾巴提起，高出桌面10 cm，正常老鼠呈現前爪伸直，記為0分，無神經功能缺損；大鼠腦部病變的對側腕關節、肘關節以肩內收屈曲，則記為1分；大鼠對側腕關節、肘關節屈曲且向麻痹側推阻力降低，記為2分；大鼠在活動時向麻痹側呈追尾狀打圈，記為3分；大鼠意識喪失、不能行走記為4分。分值范圍為0～4分，分值越高則說明大鼠神經功能損傷程度越嚴重。

1.3.3 腦組織病理檢查： 模型建立5 d后將大鼠斷頭處死，取1 cm×1 cm腦組織保存在-50℃的冰箱中。應用前1 d取出，冰浴3 min后，離心取上清液，保存至-50℃的冰箱中。為了防止細胞自溶，放入濃度為10%福爾馬林中固定處理24 h，使組織細胞中的蛋白凝固變性。將固定好的腦組織用不同梯度的酒精進行脫水處理，去除組織塊中的水分，然后再將組織放入二甲苯中進行透明處理。將透明處理過的組織放入融化的石蠟中浸蠟，然后將已經浸透好石蠟的組織塊夾取放入包埋盒中，使其冷卻凝固。將包埋好的組織蠟塊放到切片機上固定，之后進行切片，厚度為5～8 μm，放入40℃的水中展開，然后貼在載玻片上，最后用烘烤箱以60℃的溫度烘烤1 h。使用二甲苯進行常規脫蠟處理2次，每次5 min，然后在梯度酒精下水化處理3 min，自來水沖洗1次；使用蘇木素染色5 min，自來水沖洗1次；使用濃度為1%的鹽酸酒精分化處理30 s，在0.2%氨水中反藍處理2 min，自來水沖洗1次；在濃度0.5%伊紅染色10 min，自來水沖洗1次；使用乙醇梯度進行脫水處理，最后用中性樹膠進行封片，使用光學顯微鏡進行圖像分析。

1.3.4 血清MMP-9、AKT和Cyt-C水平檢測： 腦出血模型建立后，在第1 d、3 d和5 d分別抽取大鼠尾部靜脈血5 ml， 離心取上層血清在-80℃環境中保存待用。采用酶聯免疫吸附試驗法檢測MMP-9、AKT和Cyt-C水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1 行為學評分比較 大鼠在第1 d、3 d、5 d的平衡木評分和Longa評分比較，模型組>假手術組>空白組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表1。

2.2 病理組織學變化比較 空白組和假手術組大鼠腦組織結構形態完整，細胞形態無異常，神經元排列規則，無神經細胞壞死、水腫以及膠質細胞增生情況；模型組大鼠腦組織形態嚴重破壞，神經元排列紊亂，神經細胞變性、腫脹、壞死，間質內出現少量的淋巴細胞浸潤和大量的中性粒細胞，同時伴有少量的膠質細胞增生狀況。圖1見封3。

2.3 神經功能缺損程度評分比較 大鼠神經功能缺損程度評分模型組>假手術組>空白組，且模型組大鼠第5 d后的神經功能缺損程度評分明顯高于第1、3 d后，隨著時間的增加神經功能缺損程度加重(P<0.05)；假手術組與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.4 血清MMP-9、AKT和Cyt-C水平比較 空白組和假手術組大鼠MMP-9、AKT和Cyt-C水平比較差異無統計學意義(P>0.05),模型組大鼠MMP-9、Cyt-C表達水平在不同時間段均顯著高于空白組大鼠和假手術組大鼠，AKT水平低于空白組和假手術組大鼠，且升高和降低趨勢隨著時間的延長而逐漸明顯， 差異均有統計學意義(P<0.01)， 見表3。

2.5 MMP-9、AKT和Cyt-C水平與腦出血程度的相關性 MMP-9、Cyt-C水平與腦出血程度呈正相關(r=0.496，P=0.024；r=0.507，P=0.020)，AKT水平與腦出血程度呈負相關(r=-0.582，P=0.018)。

表1 3組大鼠平衡木評分和Longa評分比較分)

表2 3組大鼠神經功能缺損程度評分比較分)

表3 3組大鼠MMP-9、AKT和Cyt-C水平比較

2.6 ROC曲線分析 對腦出血大鼠MMP-9、AKT和Cyt-C指標進行ROC曲線下面積分析，ROC曲線下面積越大診斷腦出血價值越大。診斷腦出血的ROC曲線下面積從大到小依次為MMP-9+AKT+Cyt-C聯合檢測(0.835，95%CI為0.768～0.886)、MMP-9(0.725，95%CI為0.724～0.813)、Cyt-C(0.682，95%CI為0.613～0.748)、AKT(0.659，95%CI為0.598～0.732)，差異具有統計學意義(F/P=8.764/0.000)。最佳臨界值MMP-9為20.37 ng/ml，Cyt-C 為2.21 U/mg，AKT為10.74 pg/ml。3項指標聯合檢測腦出血的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為67.55%、68.97%、72.51%和76.64%，Youden指數為0.725； MMP-9檢測腦出血的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為51.72%、48.28%、55.17%和62.64%，Youden指數為0.621；Cyt-C檢測腦出血的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為62.07%、48.28%、55.17%和60.50%，Youden指數為0.654；AKT檢測腦出血的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為55.17%、51.72%、58.62%和63.66%，Youden指數為0.534，見圖2。

圖2 MMP-9、AKT和Cyt-C指標診斷腦出血ROC分析

3 討 論

腦出血的常見發病原因主要是動脈瘤、高血壓、動脈硬化和腦血管畸形等病變，但是關于腦出血的發病機制尚不明確。對腦出血患者預后產生影響的重要因素是腦實質出血所形成的血腫，血腫對腦組織造成了直接性的壓迫損傷，導致腦組織缺血缺氧，產生神經功能障礙[7-8]。

實驗大鼠在腦出血模型建造成功后，其MMP-9水平相比空白組和假手術組大鼠水平明顯上升，說明MMP-9參與了腦出血的發病過程。MMP-9是MMP家族的重要成員，屬于一類非常重要的細胞外基質蛋白酶，能夠對明膠、彈性蛋白、膜周蛋白ZO-1、Ⅳ型膠原等產生分解作用，而被MMP-9所分解的物質對血腦屏障功能有著組成作用，所以，MMP-9通過對機體血腦屏障基底物質的分解，從而使腦血管膜的完整性被破壞，導致腦出血的發生，同時又能使血管內的各種物質進入到腦實質區域，加重了腦出血的程度以及對神經功能的損傷[9-10]。寧培云等[11]在其研究中支指出，MMP-9是一種炎性介質，MMP-9水平的升高可以使白細胞介素-1、腫瘤壞死因子α以及中性粒細胞產生聚集作用，加重腦組織的炎性反應。本研究腦出血模型大鼠MMP-9表達水平的升高說明MMP-9能夠對血腦屏障功能組成物質產生分解作用，破壞腦血管膜的完整性，且MMP-9水平越高，腦出血癥狀越嚴重。

在對腦出血模型大鼠AKT和Cyt-C檢測分析中，腦出血大鼠AKT水平在模型建造成功后隨著時間增長而顯著降低，Cyt-C水平逐漸上升，說明AKT和Cyt-C均與腦出血的發病機制有著密切的關系。AKT是一種相對分子質量為57kDa的蘇氨酸激酶，作為PI3K/AKT信號轉導通路的關鍵蛋白，對細胞的分化、增殖以及抑制神經細胞凋亡方面都發揮著重要的作用，與PKC和PKA家族具有同源性[12-14]。所以AKT也稱PKB，機體在產生腦出血癥狀后，會將一些具有酪氨酸激酶活性受體激活的物質釋放出來，與PI3K的調節亞基產生特異性結合，從而激活PI3K[15]。PI3K被激活后會在細胞膜上形成第二信使，與磷酸肌醇依賴性蛋白激酶和含有PH結構域的信號蛋白AKT相結合，導致AKT的活化，還能夠直接磷酸化多種轉錄因子，通過對這些因子的調控來實現抑制凋亡基因的表達，增強抗凋亡基因的表達，使細胞的存活率升高[16-17]。本文實驗大鼠腦出血的發生抑制了AKT的活化作用，使抗凋亡基因的表達也隨之降低，無法提升正常細胞的存活率。Cyt-C是一種水溶性蛋白，也是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體，對線粒體能量代謝起到重要的調節作用[18-19]。殷旭華等[20]在其研究中指出，目前Cyt-C在線粒體中的釋放機制主要包括2種，一種是對促凋亡基因Bax產生誘導作用，導致細胞凋亡；另一種是在線粒體外膜蛋白聚合形成PTP復合體，致使外膜產生非特異性斷裂。在本文研究中腦出血模型大鼠Cyt-C表達水平顯著上升，說明Cyt-C能夠起到重要的調節作用，誘導促凋亡基因的產生。在MMP-9、AKT和Cyt-C檢測腦出血的診斷價值判斷中，3項指標在腦出血的發病中均呈特異表達，但是3項指標聯合檢測的特異度、準確度和陽性預測值更高，對疾病的早期診斷和預后有著重要參考價值。

綜上所述，MMP-9、AKT和Cyt-C在腦出血的發病中均具有特異性表達，3項指標聯合檢測的診斷效能較高，能夠為臨床腦出血的治療及預后提供重要的理論依據。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

束坤、林濤、解利平：課題設計，設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫，論文修改；劉卓：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核，進行統計學分析