單甲基亞砷酸聯合隱丹參酮抑制多發性骨髓瘤U266細胞增殖作用機制的研究

李 爽鄒建華葉曉鷗張光霽陳 喆

多發性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一種常見的血液系統漿細胞惡性腫瘤，以漿細胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或者輕鏈蛋白過度增生為特征。MM常以骨痛為主要臨床表現，屬中醫“骨痹”、“虛勞”、“骨蝕”等范疇。近年來由于MM化療耐藥，患者多數因耐藥復發而死亡[1-2]。三氧化二砷（Arsenictrioxide，As2O3）為中藥砒霜的有效成分，具有蝕瘡、去腐、殺蟲、劫痰定喘、劫瘧功效。我國學者首先發現As2O3治療急性早幼粒細胞性白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）效果顯著，并闡明其主要作用機制是通過促進PML-RAR融合蛋白的降解[3-4]。研究表明，無機砷（As2O3）在體內通過肝臟甲基轉移酶作用下生成單甲基亞砷酸（monomethylarsenous acid，MMAⅢ）、二甲基亞砷酸（dimethylarsenous acid，DMAⅢ）等活性代謝產物從而發揮相應的生物學效應[5-6]。丹參具有活血化瘀、涼血消癰作用，主治癥瘕積聚、瘡瘍腫痛，為臨床抗腫瘤的常用中藥。隱丹參酮（Cryptotanshinone，CPT）是丹參的有效活性成分，具有較強的抗腫瘤作用。體外研究表明，CPT能明顯誘導肝癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞凋亡[7]。本研究觀察隱丹參酮聯合MMA III協同抗多發性骨髓瘤U266細胞的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料 多發性骨髓瘤U266細胞和單甲基砷酸（MMAV）由浙江大學藥學院那仁滿都拉教授饋贈。隱丹參酮（CPT）分子式C19H20O3，相對分子質量296.35，購置于Selleck（中國上海藍木化工有限公司）（批次：S228502）。

1.2 細胞培養 多發性骨髓瘤U266細胞用含10%gibco胎牛血清的RPMI1640培養液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中常規培養。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖能力 常規培養多發性骨髓瘤U266細胞。按隱丹參酮單藥組、MMAIII單藥組、聯合組分別加藥處理。隱丹參酮組加入不同濃度的隱丹參酮（0、5、10、15、30、50μM）、MMAIII組加入不同濃度的單甲基亞砷酸（0、0.5、1、2、5、10μM），聯合組加入濃度為15μM的隱丹參酮和1μM的單甲基亞砷酸。加入CCK-8并在培養箱中孵育后，檢測吸光度值(OD值)，并計算細胞存活率。

1.4 PI/Annexin-V流式細胞術檢測細胞凋亡 隱丹參酮單藥組（15μM）、MMAIII單藥組（1μM）和聯合組分別處理細胞后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中孵育24h。收集細胞，AnnexinⅤ-FITC和PI染料處理并孵育后流式細胞儀FITC-PI模式下檢測細胞凋亡率。

1.5 Western Blot檢測PARP凋亡蛋白 研究共分為隱丹參酮單藥組（15μM）、MMAIII單藥組（1μM）、聯合組。十二烷基磺酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠后進行蛋白印跡（Western Blot）檢測。特異性一次抗體為抗 Parp、Cleaved-parp、Cleaved-Caspase3（分別 1:1000稀釋）；特異性二次抗體為HRP標記的抗兔或抗小鼠二次抗體。QuantityOne軟件進行量化分析蛋白表達水平，β-actin蛋白水平作為內參。

1.6 酸性鞘磷脂酶活性測定 凍融法裂解細胞，應用BCA法測定蛋白濃度，用1mMPMSF稀釋樣品。每孔加入20μL被PMSF稀釋的含20μg蛋白的樣品液。向96孔板中加入樣品液每孔20μL含20μg蛋白，每組兩復孔。每孔加入30μL底物緩沖液K-3203水平搖床混合5min后每孔加入50μL稀釋好的酸性鞘磷脂酶底物（酸性鞘磷脂酶底物k-3202：底物緩沖液k-3203=1：40）混合均勻后水平恒溫搖床37℃孵育3h。在室溫下每孔加入50μL終止緩沖液k-3204避光室溫水平搖床孵育10min，多功能酶標儀激發波長360nm發射波長460nm下檢測讀板，軟件Prism 6.0繪制曲線。

1.7 免疫熒光檢測神經酰胺生成與聚集情況 隱丹參酮單藥組、MMAIII單藥組、聯合應用組分別加藥處理，0、1、2、4、8h 后收集細胞。用細胞涂片離心機（1500rpm，2min）將細胞轉移到細胞爬片上晾干。干燥后的細胞爬片放入4%多聚甲醛固定15min，再用PBS洗3次，5min/次動作輕柔避免細胞從爬片上脫落。封閉液（含5%BSA的PBS溶液）封閉1h。一抗神經酰胺（ceramide，1：100稀釋）4℃過夜。再用 PBS洗3次，5min/次。室溫避光孵育二抗1h。再用PBS避12光洗3次，5min/次。在暗室中取出細胞爬片濾紙吸干多余的水分，將載玻片上滴加約10μL的不含DAPI的封片劑（Southern Biotech），將含有細胞側的玻片輕輕覆蓋在封片劑上，避免出現氣泡。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 免疫熒光檢測脂筏聚集情況 常規培養人多發性骨髓 U266細胞，接種于 24孔板中（4×104個/孔）待細胞生長至50～60%融合率后按空白對照組，聯合應用組，Filipin組（filipin預處理2h后再加入隱丹參酮15μM和單甲基亞砷酸1μM）分別加藥處理3h后收集細胞PBS洗2遍后。用細胞涂片離心機（1500rpm，2min）將細胞轉移到細胞爬片上晾干。干燥后的細胞爬片放入4%多聚甲醛固定15min，再用PBS洗3次，5min/次動作輕柔避免細胞從爬片上脫落。封閉液（含5%BSA的PBS溶液）封閉1h。脂筏特異性熒光標記物霍亂毒素B（choleratoxinB，CTB）：37℃避光孵育1h，再用PBS避光洗3次，5min/次。在暗室中取出細胞爬片濾紙吸干多余的水分，將載玻片上滴加約10μL的含DAPI的封片劑（Southern Biotech），將含有細胞側的玻片輕輕覆蓋在封片劑上，避免出現氣泡。激光共聚焦微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 單甲基亞砷酸聯合隱丹參酮協同應用顯著抑制多發性骨髓瘤細胞增殖 隱丹參酮濃度為15μM時細胞存活率為 （80.9±5.4）%（24h）、（60.0±8.4）%（48h），單甲基亞砷酸濃度為1μM時細胞存活率為（82.5±5.8）%（24h）、（67.7+9.7）%（48h），隱丹參酮（15μM）聯合單甲基亞砷酸（1μM）作用于多發性骨髓瘤U266細胞24h、48h后細胞存活率為（29.1±7.0）%（24h）、（18.0±2.7）%（48h）。上述實驗結果表明，隱丹參酮、單甲基亞砷酸對多發性骨髓瘤的增殖抑制作用呈濃度及時間依賴性，且隱丹參酮（15μM）及單甲基亞砷酸（1μM）聯合作用U266具有顯著的協同效應，其對細胞增殖的抑制作用明顯優于單獨應用（P＜0.01）（見插頁圖 1）。

圖1 隱丹參酮單藥組、單甲基亞砷酸單藥組及聯合用藥組對人多發性骨髓瘤U266細胞增殖抑制作用

2.2 單甲基亞砷酸聯合隱丹參酮協同作用顯著促進多發性骨髓瘤U266細胞凋亡發生 單甲基亞砷酸單藥組（MMAIII，1μM），隱丹參酮單藥組（CPT，5μM），聯合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白對照組分別作用于對數生長期的多發性骨髓瘤U266細胞24h，經AnnexinV-FITC/PI染色后，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果顯示，聯合用藥組細胞凋亡率為（41.7±4.4）%、單甲基亞砷酸組為（10.6±4.0）%、隱丹參酮組為（10.5±3.0）%。上述結果顯示聯合用藥組較單甲基亞砷酸單藥組、隱丹參酮單藥組能顯著促進多發性骨髓瘤U266細胞發生凋亡（P＜0.01）（見插頁圖 2）。

圖2 隱丹參酮聯合單甲基亞砷酸協同作用顯著誘導U266細胞凋亡發生

2.3 單甲基亞砷酸聯合隱丹參酮協同作用能夠活化多發性骨髓瘤U266細胞凋亡標記蛋白 單甲基亞砷酸單藥組（MMAIII，1μM），隱丹參酮單藥組（CPT，15μM），聯合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白對照組分別作用于對數生長期的多發性骨髓瘤U266細胞24h后，收集細胞提取細胞總蛋白Western Blot法檢測PARP凋亡蛋白活化情況，結果顯示，聯合作用組凋亡蛋白PARP剪切活化水平較單甲基亞砷酸單藥組及隱丹參酮單藥組有顯著升高（見插頁圖3）。上述結果說明單甲基亞砷酸聯合隱丹參酮通過活化凋亡標記蛋白進而誘導多發性骨髓瘤U266細胞凋亡發生。

圖3 隱丹參酮聯合單甲基亞砷酸協同作用促進U266細胞凋亡相關蛋白剪切活化

2.4 單甲基亞砷酸聯合隱丹參酮協同作用促進多發性骨髓瘤U266細胞神經酰胺的生成 單甲基亞砷酸單藥組（MMAIII，1μM），隱丹參酮單藥組（CPT，15μM），聯合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白對照組分別作用于對數生長期的多發性骨髓瘤U266細胞。收集細胞處理樣本后，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞膜上神經酰胺生成聚集情況。結果顯示，上述藥物作用2h，單甲基亞砷酸及隱丹參酮單獨作用組神經酰胺熒光亮度與對照組無明顯差別，聯合用藥組熒光亮度則明顯增強（見插頁圖4），上述實驗結果說明藥物聯合作用較單獨作用顯著促進人多發性骨髓瘤細胞神經酰胺的生成。

圖4 隱丹參酮聯合單甲基亞砷酸協同作用促進U266細胞膜上神經酰胺生成

2.5 單甲基亞砷酸聯合隱丹參酮協同作用顯著增加多發性骨髓瘤U266細胞的酸性鞘磷脂酶活性 單甲基亞砷酸單藥組（MMAIII，1μM），隱丹參酮單藥組（CPT，15μM），聯合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白對照組分別作用于對數生長期的多發性骨髓瘤U266細胞。收集細胞處理樣本后，檢測酸性鞘磷脂酶活性。結果顯示，聯合用藥1h，能顯著激活酸性鞘磷脂酶活性（見插頁圖5）。上述結果說明單甲基亞砷酸聯合隱丹參酮聯合用藥能夠激活多發性骨髓瘤U266細胞的酸性鞘磷脂酶活性，進而促進神經酰胺的生成。

圖5 隱丹參酮聯合單甲基亞砷酸協同作用活化U266細胞酸性鞘磷脂酶

2.6 脂筏抑制劑Filipin能夠干預單甲基亞砷酸聯合隱丹參酮誘導的多發性骨髓瘤U266細胞凋亡標記蛋白的剪切活化 空白對照組，聯合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及 Filipin組（脂筏抑制劑Filipin1μg/mL預處理 2h后再加入 15μMCPT和1μMMMAIII）分別作用于對數生長期的多發性骨髓瘤U266細胞24h后，收集細胞提取細胞總蛋白Western Blot法檢測 cleaved-Parp，cleaved-Caspase3凋亡蛋白活化情況，結果顯示，脂筏抑制劑Filipin能夠抑制凋亡蛋白cleaved-Parp，cleaved-Caspase3活化水平（見插頁圖6）。

圖6 脂筏抑制劑Filipin干預隱丹參酮聯合單甲基亞砷酸誘導多發性骨髓瘤U266細胞凋亡的作用效應

2.7 脂筏抑制劑Filipin能夠干預單甲基亞砷酸聯合隱丹參酮引起的脂筏聚集 空白對照組，聯合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及 Filipin組（脂筏抑制劑Filipin1μg/mL預處理2h后再加入 15μMCPT和1μMMMAIII）分別作用于對數生長期的多發性骨髓瘤U266細胞3h后，收集處理樣本，激光共聚焦顯微鏡觀察。結果顯示，聯合用藥后多發性骨髓瘤U266細胞膜上熒光強度增加，加入Filipin后熒光強度較聯合用藥減少。上述結果說明脂筏抑制劑Filipin能夠抑制聯合用藥引起的脂筏在細胞膜上的聚集（見插頁圖7）。

圖7 脂筏抑制劑Filipin能夠干預單甲基亞砷酸聯合隱丹參酮引起的脂筏聚集

3 討論

已有文獻報道，As2O3可以抑制多發性骨髓瘤細胞增殖及誘導其凋亡發生，研究結果顯示，As2O3引起MM細胞線粒體膜電位發生變化，增大線粒體內膜通透性促進細胞色素C的釋放激活Caspase家族蛋白誘導細胞凋亡發生[8-9]。MMAIII是中藥砒霜As2O3在體內的活性代謝產物，其生物學活性遠強于后者。As2O3進入人體后迅速在肝臟砷甲基轉移酶的作用下轉化為有機形態的活性代謝產物單甲基亞砷酸[10]。Wang等[11]發現MMAIII能夠促進線粒體細胞色素C的釋放誘導小鼠肝細胞凋亡發生。Chen等[12]報道，有機活性代謝產物MMAIII抗白血病和淋巴瘤細胞活性明顯強于無機形態的As2O3，且對正常骨髓組織無毒副作用。本課題組前期研究發現，隱丹參酮（CPT）聯合As2O3協同作用于多發性骨髓瘤U266細胞較單藥作用具有更加顯著的促凋亡效應[13]，在此基礎上本課題組進一步探究As2O3活性代謝產物單甲基亞砷酸聯合隱丹參酮的協同作用效果。

神經酰胺是重要的生物活性鞘脂類，作為第二信使廣泛參與細胞信號轉導[14-15]，在促進和調節許多包括細胞凋亡、分化、衰老等細胞過程中扮演著重要的角色[16-19]。有研究表明，這種調節作用與細胞膜上的神經酰胺，尤其與脂筏密切相關[20]。脂筏是一種筏狀的膜結構域，由鞘磷脂及膽固醇聚集形成。膽固醇填充在鞘磷脂雙層中的疏水空間內形成這種更緊湊的微區膜結構[21]。研究證實，脂筏在細胞信號跨膜轉導中發揮著重要作用。大量受體分子或刺激分子可以引起酸性鞘磷脂酶（ASMase）的激活導致神經酰胺的釋放，促使細胞膜上小的無活性的脂筏逐漸形成大的有活性的富含神經酰胺的平臺結構，使得受體等信號分子跨膜轉導[21-23]。脂筏抑制劑Filipin能夠破壞脂筏的結構，阻止富含神經酰胺的脂筏平臺形成，抑制信號的跨膜轉導效應[24-25]。

本研究發現，隱丹參酮聯合單甲基亞砷酸協同作用能夠活化多發性骨髓瘤U266細胞酸性鞘磷脂酶活性，促進細胞膜上神經酰胺生成，迫使細胞膜上脂筏增大。聯合用藥1h能夠顯著活化U266細胞酸性鞘磷脂酶活性，聯合用藥2h能夠促進U266細胞膜上神經酰胺的生成，酸性鞘磷脂酶的活化早于神經酰胺的生成，隨著細胞膜上神經酰胺的增多脂筏不斷的形成增大，并且下游凋亡蛋白的表達被激活。

綜上所述，本研究得出隱丹參酮聯合單甲基亞砷酸協同作用能夠上調多發性骨髓瘤U266細胞酸性鞘磷脂的活性，促進細胞膜上鞘磷脂水解生成神經酰胺，進一步形成富集神經酰胺的脂筏并激活U266細胞下游凋亡信號通路。本研究結果表明，隱丹參酮聯合MMAIII具有協同抗MM作用，有望為MM的臨床治療帶來新思路。