激光針刀對椎動脈型頸椎病模型兔椎動脈磷脂酰肌醇3-激酶mRNA表達的影響

劉 芳 魏 威 劉承浩 汪存信 葉麗紅 劉 敏

椎動脈型頸椎病（Cervical spondylotic arteriopathy，CSA）是頸神經根、脊髓、椎動脈和頸部交感神經等受到刺激和壓迫而出現的一系列綜合癥候群，屬中醫“眩暈”、“中風先兆”等范疇[1-2]。研究表明，CSA 的發生與椎動脈血管狹窄、閉塞、迂曲形態密切相關[3]。針灸是CSA的傳統治療方法，已廣泛運用于臨床，但存在治療次數多，療效不持久易復發等缺點[4-5]。項目組前期采用激光針刀治療椎動脈型頸椎病取得了一定臨床療效，經三維建模和有限元分析表明激光針刀能明顯改善血管狹窄程度，從而有效改善局域血液循環[6]。但目前關于激光針刀治療椎動脈型頸椎病的治療機制尚不明確。PI-3K（phosphatidylinositol 3-kinase）是胞內具有催化活性的信號蛋白，其激活的結果是在質膜上產生第二信使PIP3，PIP3與細胞內含有PH結構域的信號蛋白AKT（Protein kinase B，蛋白激酶B）和PDK1（Phosphoinositide dependent kinase-1，3-磷酸肌醇依賴蛋白激酶1）結合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308導致AKT活化，形成PI-3K/AKT信號轉導通路。近年研究發現，電針可增加基質細胞衍生因子SDF-1的表達[7]，電信號通過激活PI3K/AKT信號通路實現控制損傷組織血管再生進程[7-8]。血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，為目前已鑒定出來的30多種與血管生成相關的因子中最重要的因子[9]。激光針刀是對傳統小針刀的改進。因此，為進一步揭示激光針刀治療椎動脈型頸椎病的治療機制，項目組通過動物實驗，對比激光針刀與針刺治療CSA的療效，探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只普通級健康成年新西蘭白兔，雌雄各半，體質量（2.50±0.20）kg，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供和飼養，動物合格證號：SYXK（浙）2013-0184。實驗動物均單籠飼養，自由攝食、飲水，自然光線照射，室溫20～22℃，濕度40～60%。

1.2 主要試劑和儀器 He-Ne激光治療儀（上海嘉定光電儀器有限公司，JH30C型），針刀（北京卓越華友醫療器械有限公司，漢章針刀HZ系列），針灸針（江蘇省吳江市佳辰針灸器械有限公司，型號0.25mm×40mm）， 高純總RNA快速提取試劑盒購自 Generay公司（貨號：GK3016；批次 1703G01）；逆轉錄試劑盒HiScript-II Q RT SuperMix for qPCR購自 Vazyme公司（貨號：R222-01；批次 7E092G6）；qPCR試劑ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix購自 Vazyme公司（貨號：Q411-02；批次 7E092H6）；實驗引物由上海桑尼生物科技有限公司合成、純化。引物序列如下：OryActinForward：AGTGCGACGTGGACATCCG；OryActin Reverse：TGGCTCTAACAGTCCGCCTAG；目標基因 Gene ID：100009272；PCR 產物大小為：295bp。OryAKTForward：ATATTCCCGTCTTT CACCCACT；Ory AKTReverse：AACGCTGTCAACCAC TTTACTT；目標基因 Gene ID：100340228；PCR 產物大小為：321bp。OryPI3KForward：GGCTCAAAGACAA GAACAAAGG；OryPI3K Reverse：CCTTGTAACACAT CTCTTGAAACC；目標基因 Gene ID：100337822；PCR產物大小為：224bp。OryVEG FForward：CCCACGAA GTGGTGAAGT；OryVEGFReverse：CTCATCTCCCCTA TGTGC；目標基因 Gene ID：100008899；PCR 產物大小為：253bp。OD值測量儀器（高精度分光光度計）為Merinton SMA4000；定量 PCR儀為 CFX connect Real-Time PCR System，配套使用的分析軟件為BIO-RAD CFX Manager；相關耗材（Tip頭、EP管等）購自Kirgen公司，均為無RNase、DNase和無熱源的分子生物學耗材。

1.3 動物造模 采用胡曉梅等[10]介紹的誘發性直接復制方法進行造模。取同種屬異體家兔耳正中動脈血與25%生理鹽水混合（比例為1：1）共9mL分別注入模型家兔右側頸夾肌，橫突間肌與橫突棘肌的肌內與肌間隙。注射前和注射2周后分別進行彩色超聲檢測，選取右側椎動脈血流速度減小＞10cm/s的兔作為成功模型。

1.4 分組與治療 將40只新西蘭白兔按隨機數字表法分為正常組、模型組、針刺組和激光針刀組，每組10只，除正常組外其它三組給予造模，2周后造模完成。正常組：不造模，僅在針刺組治療的同時對兔給予相同的固定操作。模型組：造模完成后，僅在針刺組治療的同時對兔給予相同的固定操作。針刺組：造模后第14天開始治療。取穴：風池穴、頸夾脊穴（C3-C7）。刺法：用30號1.5寸毫針于上述六個穴位直刺，施以捻轉補瀉手法，得氣后留針30min，其間隔10min行針1次。隔天治療1次，10次為1個療程，治療10次，治療20天床邊超聲檢測后處死家兔。激光針刀組：造模14天后開始治療。具體操作：（1）體位：用固定盒將家兔固定，取俯臥位、頸椎前屈，沿棘突及椎旁選定C5頸椎棘突旁夾脊穴（雙）作為治療點（遵照實驗動物穴位圖譜）；（2）皮膚消毒：常規碘伏皮膚消毒；（3）1%利多卡因局部麻醉；（4）激光針刀進行定點切割、剝離、松解、手感無結節、阻滯，留針He-Ne激光輻射，激光輸出功率200mW，擴束光斑模式，通斷方式輸出，總時間為30min，出針后創可貼外敷，24h內保持創口干燥。治療每10天1次，3次為1個療程，治療20天彩色超聲檢測后處死家兔。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 激光針刀對家兔行為體征和體質量的影響

從造模當天開始，每天觀察家兔的精神（眼瞼、運動情況）、皮毛光澤、鼻尾色、大便狀況及有無縮肩拱背以及覓食等情況，3天記錄1次。分別于造模前1天、造模后第14天（治療前）、造模后第24天（治療10天后）、造模后第34天（治療20天后）稱取記錄體質量。

1.5.2 激光針刀對CSA兔PI-3K mRNA表達的影響 Trizol-離心柱法提取樣本總RNA。RNA純度的測定和RNA的定量，以相應溶劑為對照（Blank），取2μL RNA溶液于Merinton SMA4000檢測，觀察A260/A280、A260/A230比值及連續波長吸收峰，并計算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質量：A260/A280＞2.0且＜2.3，則可以滿足后續RT-qPCR所需。逆轉錄實驗。然后熒光定量PCR擴增實驗。qPCR實驗參數：95.0℃ for 30s，95.0℃ for 10s，60.0℃ for 30s Plate Read，GOTO 2，40 reps，Melt Curve 70℃to 95℃：Increment 0.5℃ for 5s Plate Read。分別檢測不同組 CSA兔 PI-3K、AKT、VEGF mRNA的變化。

1.6 統計學方法 測定的數據均采用SPSS17.0統計軟件包建立實驗結果數據庫并進行統計分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，采用雙側檢驗，符合正態性和方差齊性的資料，采用單因素方差（ANOVA）分析；P＜0.01或P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 激光針刀對CSA兔體質量的影響 造模后三組CSA模型兔出現不同程度的精神萎靡或縮肩拱背、活動減少等情況，針刺組和激光針刀組兔經治療后，一般情況有不同程度的改善。隨著飼養時間的增加，正常組兔體質量呈現逐漸增高的趨勢。造模后14d（治療前），與正常組比較，三組CSA模型兔體質量顯著降低（P＜0.05）。造模后24天（治療10天后），模型組兔體質量明顯低于正常組（P＜0.01），針刺組、激光針刀組兔體質量與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，針刺組、激光針刀組兔體質量明顯高于模型組（P均＜0.05）。造模后34天（治療20天后），模型組兔體質量明顯低于正常組（P＜0.01），針刺組、激光針刀組兔體質量與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05），與模型組比較，針刺組與激光針刀組兔體質量均明顯高于模型組（P均＜0.01）。見表 1。

2.2 激光針刀對CSA兔PI-3K mRNA表達的影響

治療結束后，采用real-time PCR法檢測各組兔右側頸動脈PI-3K mRNA平均表達量結果如表2所示。與正常組比較，模型組兔頸動脈PI-3KmRNA表達明顯低于正常組（P＜0.01），針刺組和激光針刀組與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。針刺組和激光針刀組兔頸動脈PI-3KmRNA表達明顯高于模型組（P＜0.05、P＜0.01），針刺組與激光針刀組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。

表1 四組新西蘭白兔不同時間點體質量比較（kg，x±s）

表2 四組新西蘭白兔右側頸動脈PI-3K mRNA表達量比較（x±s）

3 討論

本研究沿用經典CSA模型制備CSA模型兔，發現實施造模后，與正常組相比模型組明顯出現活動減少、反應遲鈍、弓背卷縮、皮毛色澤變差，飲水量和進食量降低，大便稀溏，耳、舌顏色暗紫。造模完成后與空白組相比，模型組兔行為學改變，血流速度顯著降低，與正常組比較差異有統計學意義（另文發表），表明CSA實驗模型造模成功。

激光針刀設備簡單、操作簡便，有效地避免了對身體造成創傷，治療效果好，且無毒副作用，患者易于接受，由于技術較新穎因此目前用于CSA的治療仍不多見。邵燕[11]等發現激光對微血管的新生有誘發作用，其機制與PI3K激活密切相關。Al Rashoud等[12]采用激光針刀治療膝關節骨性關節炎，認為激光針刀能促使毛細管擴張和改善局部血液循環，提高痛閾，達到鎮痛效果，同時還具有明顯的消炎作用，從而減輕患者疼痛，改善生活質量。Huang等[13]采用激光針刀治療顳下頜關節紊亂病，也發現激光照射可緩解疼痛、放松肌肉和促進血液循環，并能調節新陳代謝，改變組織病理狀態和促進組織健康的恢復，而且安全高效無副作用。激光針刀本質上是一種能量轉化和傳遞的過程，經激光照射的組織吸收了一定的光子后，將光能轉化為熱能，使局部溫度升高，擴張血管并促進血管新生，改善血液循環，恢復血液動力平衡，促進新陳代謝。由于CSA的主要病因為錐-基底動脈供血不足導致局部腦血流量的降低，故從理論上來講激光針刀尤其適用于CSA的治療。

PI-3K是胞內具有催化活性的信號蛋白，其激活的結果是在質膜上產生第二信使PIP3，PIP3與細胞內含有PH結構域的信號蛋白AKT和PDK1結合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308導致AKT活化，形成PI-3K/Akt信號轉導通路[14-15]。AKT磷酸化和滅活結節硬化性因子2，因此誘導活性Rheb形成[16]，Rheb反過來磷酸化活化哺乳動物雷帕霉素靶蛋 白 （Mammalian target of rapamycin，mTOR）[17]，mTOR可直接增強（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的轉錄活性導致其轉移至細胞核中，與結構性亞基HIF-1β形成HIF-1異二聚體復合物而活化，再與HIF-1α靶基因中的低氧反應元件結合調節靶基因的轉錄活性[18]。HIF-1α所調節的靶基因主要功能為促進血管生成增加局部氧流量。VEGF是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，為目前已鑒定出來的30多種與血管生成相關的因子中最重要的因子。在低氧條件下，VEFG可被HIF誘導而轉錄激活[19]，其生物作用主要體現在兩方面：（1）促進血管內皮細胞的分裂和增殖，從而生成新生血管[20]；（2）作為血管通透因子可以增加微血管的通透性[21]。從本項目階段性研究結果來看，激光針刀復合療法治療CSA的主要機制可能是通過PI3K-AKT-VEGF信號通路刺激椎動脈微血管的生成，從而有效改善椎動脈血管的血液循環狀況，改變由于CSA導致的椎動脈血流動力學異常現象，從而改善局部血供。