白芨水煎劑對結腸黑變病模型豚鼠結腸上皮細胞凋亡及凋亡相關蛋白的影響

張兆林 陳凍伢 徐 虹 徐建軍 馮 慧 陳建永

結腸黑變病（Melanosis coli，MC）指結腸黏膜固有層內巨噬細胞含脂褐素（Lipofuscin）或黑色素（Melanin）的一種黏膜色素沉著性病變。MC多見于長期便秘以及服用蒽醌類（Anthraquinone）藥物的患者[1]。大劑量連續服用1～4個月，即可見一定程度MC的發生。MC患者結腸黏膜出現增生性病變的機會大大增加，其中結腸癌和結腸腺瘤性息肉的發生率高，少數患者還可出現假性腸狹窄[2]。目前普遍認為MC與結腸上皮細胞凋亡存在一定的相關性。腫瘤細胞壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF-α）能夠誘導細胞凋亡。B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bax）在細胞凋亡中起著關鍵作用，是一對具有拮抗作用的基因。藥理研究證實，白芨水煎劑灌服能保護大鼠胃黏膜，抑制潰瘍發生；還能促進表皮損傷的愈合，促進基底膜修復[3]。本研究通過大黃提取液灌胃制備MC模型豚鼠，并予10%白芨水煎劑灌腸，通過檢測腸黏膜上皮細胞的凋亡以及TNFα、Bcl-2和Bax表達，探討白芨水煎劑對蒽醌類藥物所致MC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物 健康豚鼠40只，雌雄各半，體質量（400g±20）g，清潔級，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，合格證號：SYXK（浙）2013-0184。采用架式籠養喂養，每籠4只，雌雄分籠喂養。普通飼料，自由飲水，室溫保持在20℃左右，相對濕度40～60%，光照周期12h。

1.2 藥 物 實驗藥物大黃、白芨均購自浙江省醫藥公司，生產單位杭州桐君堂中藥飲片廠，批號20150713。大黃提取工藝：大黃飲片機械粉碎成70mm粗粉，8倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5h。提取液合并過濾，60℃減壓濃縮，制成大黃提取液（每1mL相當于生藥3g），置4℃冰箱保存。10%白芨水煎劑制備工藝：白芨干燥，粉碎，水提取前冷浸30min，加入10倍蒸餾水煎煮2次，共煎煮2h。無菌4層紗布過濾雜質，合并濾液濃縮，制成白芨水煎劑（每1mL相當于生藥0.1g），置4℃冰箱保存備用。

1.3 主要試劑 原位細胞凋亡熒光檢測試劑盒購自德國Roche公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術公司；抗TNFα小鼠單克隆抗體購自美國Abcam公司；抗Bcl-2兔多克隆抗體、抗Bax兔多克隆抗體、抗GAPDh小鼠單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.4 MC豚鼠模型制備 將40只豚鼠適應性喂養7d后，采用隨機數字表法分為三組，正常組8只，模型組16只，白芨水煎劑組16只。模型組及白芨組均予大黃提取液6g·kg-1·d-1連續灌胃60天，造模第3周模型組開始予生理鹽水灌腸，白芨組予10%白芨水煎劑灌腸，每周3次，灌腸方法如下，將8F導尿管涂抹凡士林后從肛門輕輕插入5cm，推入2mL藥液并捏緊肛門倒放5min。造模結束后，各組豚鼠予25%烏拉坦按0.7mL/100g腹腔麻醉處死。處死前豚鼠均禁食、禁水24h。處死后立刻剖取盲腸及全部結腸，取適量結腸標本，用4℃生理鹽水反復清洗腸腔內容物，置于10%中性甲醛液及液氮中保存備用。

1.5 結腸組織蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和黑色素染色 取10%中性甲醛液固定組織，石蠟包埋切片，切片厚度3～5μm，常規HE染色后光學顯微鏡下觀察。取石蠟包埋的組織，切片厚度3～5μm，脫蠟洗滌后投入M.F.溶液中，置于暗室12h，投入5%硫代硫酸鈉2min，用中性紅復染后脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察。

1.6 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記（Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）染色 操作步驟根據Roche公司的In Situ Cell Death Detection Kit Fluorescein說明書進行：烤片2～3h脫蠟后二甲苯浸洗，依次用梯度乙醇浸洗，0.01M PBS沖洗后抗原修復，滴加封閉用正常山羊血清室溫孵育30min，滴加50μL TUNEL反應液37℃避光孵育60min，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，激發光波長450～500nm，檢測波長515-565nm（綠色），計數凋亡細胞。

1.7 免疫印跡 取各組離體的豚鼠結腸加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組取50μg樣品蛋白，進行12%SDS-PAGE電泳。將膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，以含5%脫脂奶粉的TTBS 液 （0.121%Tris，0.9%NaCl，0.1%Tween-20，ph7.5）室溫封閉1h。加入抗TNFα小鼠單克隆抗體（1:1000），抗 Bcl-2兔多克隆抗體（1:500）或抗 Bax兔多克隆抗體（1:500）4℃孵育過夜，TTBS洗膜3次，除去未結合的一抗，然后相應加入hRP藕聯兔抗小鼠IgG或hRP藕聯山羊抗兔IgG，室溫孵育1h。TTBS洗膜3次后進行ECL顯影曝光。

1.8 統計學方法 應用SPSS20.0軟件包對數據進行統計處理。數據資料用均數±標準差（x±s） 表示。多組樣本均數比較采用單因素方差分析，用LSD Post hoc Tests檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸黏膜黑變病評分 肉眼觀察正常組豚鼠結腸呈淺紅色，未見明顯色素沉著。模型組及白芨組豚鼠結腸則有不同程度的黑變出現。以盲腸與近端結腸最為顯著，其余小腸等組織未見黑變。病變結腸黏膜尚光滑，反光較差，彈性降低，表面呈淺褐色或深褐色，與正常腸黏膜分界不清。白芨組豚鼠結腸黏膜顏色較模型組淺，黑變組織面積少（見插頁圖1）。

圖1 各組豚鼠結腸黏膜

圖2 結腸組織hE和黑色素染色（×200） （A）hE染色；（B）黑色素染色

圖3 豚鼠結腸組織TNFα蛋白表達

圖4 豚鼠結腸組織Bcl-2和Bax蛋白表達

用10%中性甲醛液固定的組織標本黏膜層朝上，平鋪在白色硬紙板上，大頭針固定，用放大鏡觀察腸黏膜標本的黑變程度并評分。評分標準[4]：無黑變0分，盲腸1分，盲腸和部分近段結腸2分，全結腸3分；顏色：淺紅色0分，淺褐色1分，暗褐色2分，深褐色3分。模型組結腸黏膜與正常組比較差異有統計學意義（P＜0.05），白芨組結腸黏膜與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組豚鼠結腸黏膜黑變病評分（分，x±s）

2.2 hE染色和黑色素染色 HE染色結果顯示，正常組豚鼠的結腸黏膜結構完整，腺體及隱窩清晰可見，黏膜固有層及黏膜下層未見炎細胞浸潤，固有層內未見含有棕褐色顆粒的巨噬細胞。模型組則見結腸黏膜上皮細胞大量脫落，固有層及黏膜下層可見明顯中性粒細胞浸潤，隱窩及腺體減少，結構紊亂，黏膜肌層與固有層間見較多棕褐色色素顆粒沉著。白芨組結腸黏膜上皮細胞少量脫落，固有層及黏膜下層可見少量中性粒細胞侵潤，固有層散在分布棕黃褐色色素顆粒（插頁圖2A）。黑色素染色如插頁圖2B所示，模型組及白芨組豚鼠的結腸黏膜呈現不同程度的陽染色素顆粒，且白芨組陽性程度較模型組輕微，正常組未見黑色素陽染區域。

2.3 各組豚鼠結腸黏膜上皮細胞凋亡檢測 采用TUNEL（FITC熒光法）對腸黏膜上皮細胞凋亡進行檢測，并使用Image-pro PLUS 5.1版圖像分析軟件，每個樣本隨機選取5個高倍視野，計數1，000個細胞采用灰度值120～145，計算陽性細胞數占總細胞數的百分比，對結腸上皮細胞凋亡的表達率進行定量分析。結果顯示，與正常組相比較，模型組豚鼠結腸黏膜上皮細胞凋亡陽性率顯著增高（P＜0.01），白芨組豚鼠結腸黏膜上皮細胞凋亡陽性率比模型組顯著下降（P＜0.01），見表 2。

表2 各組TUNNEL染色陽性率比較（%，x±s）

2.4 各組豚鼠結腸組織TNFα表達 與正常組比較，模型組豚鼠結腸組織TNFα蛋白表達量顯著增高，為正常組的 4.27倍（P＜0.01）。白芨組豚鼠結腸TNFα表達量較模型組顯著下降，為模型組的54.6%（P＜0.01），見表 3，插頁圖 3。

表3 各組豚鼠結腸組織TNFα表達水平比較（x±s）

2.5 各組豚鼠結腸組織Bcl-2和Bax表達 與正常組比較，模型組豚鼠結腸組織Bcl-2蛋白表達量顯著增加，為正常組的3.68倍（P＜0.01）。白芨組的Bcl-2表達為模型組的 47.8%（P＜0.01）。相反，模型組豚鼠結腸組織Bax的表達量與正常組相比顯著下降，為正常組的45.0%（P＜0.01）。白芨組Bax表達比模型組顯著增高，為模型組的 1.96 倍（P＜0.01）。見表 4，插頁圖4。

3 討論

目前普遍認為蒽醌類瀉藥如美鼠李皮、番瀉葉、大黃等為主的蒽醌類瀉藥長期服用為MC發生的主要因素[5]。劉中輝等[6]在回顧性研究350例完成結腸鏡檢查的患者中，結腸黑變病組結腸息肉發現率達40.8%，遠高于非結腸黑變病的23.0%，認為MC患者結腸息肉發生率高。此外，有研究發現MC與結腸癌存在一定的關系[7]。

表4 各組豚鼠結腸組織Bcl-2和Bax表達水平比較（x±s）

Byers等[8]指出，結腸上皮凋亡數目與MC嚴重程度呈正相關。Chiu等[9]研究認為，大黃素等游離蒽醌可通過Bax與Fas信號轉導途徑誘導腫瘤細胞發生凋亡。Britta等[10]發現，長期服用瀉藥患者的結腸黏膜Bcl-2表達增加。長期服用蒽醌類瀉藥可使腸黏膜上皮細胞損傷、凋亡，產生的凋亡小體透過基底膜小孔轉移至黏膜固有層。此類物質在巨噬細胞中形成次級溶酶體的過程中，因溶酶體過載，導致細胞分解代謝障礙，最終持續形成大量脂褐素或黑色素。隨著長期應用蒽醌類瀉藥，最終形成典型的MC[11]。TNFα可以增加白細胞以及血管壁的黏附性，以致微血管遲發性低灌注，對毛細血管有直接的毒性作用，且能誘導敏感細胞發生壞死和凋亡[12]。在細胞的凋亡調控過程中，各種基因之間存在著相互作用，其中Bcl-2和Bax被認為在其中起著關鍵作用。在正常結腸組織Bcl-2表達較弱，而從腺瘤到腺癌進展過程中，Bcl-2表達明顯增強[13]。Bax存在于Bcl-2家族中，是促進凋亡的相關蛋白。Bcl-2/Bax比值決定細胞凋亡的發生與否，對凋亡的發生過程起著重要的調控作用[14]。

曾頌[3]研究指出，白芨水煎劑灌服能夠保護大鼠胃黏膜，抑制潰瘍發生，這可能與刺激胃黏膜合成與釋放內源性前列腺素（Prostaglandin，PG）有關。白芨還可以促進表皮損傷的愈合，加快基底膜修復。電鏡下對二甲氨基偶氮苯（Dimethylaminoazobellzane，DAB）誘導的大鼠肝癌細胞核增大，核膜彎曲凹陷，而予白芨注射液的肝細胞形態與正常肝細胞形態相近[15]。

本研究結果表明，白芨水煎劑可能通過抑制MC豚鼠結腸組織TNFα和Bcl-2蛋白表達，增加Bax表達，降低Bcl-2/Bax比值，抑制結腸上皮細胞凋亡，從而改善MC。