人乳頭瘤病毒16型和18型E6蛋白單抗制備及其鑒定

夏 斌，王芙蓉，嚴茹紅，朱紅楠，蔡培培△

(1.蘇州科技城醫院檢驗科，江蘇蘇州 215153；2.南京醫科大學附屬蘇州醫院檢驗科，江蘇蘇州 215153)

宮頸癌是現代女性常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內每年都有將近50萬人新患宮頸癌，我國宮頸癌患病率就占了25%[1-5]，研究發現99%以上的宮頸癌都能夠找到人乳頭瘤病毒(HPV)感染的跡象，這些感染中主要型別是HPV16(約占53%)和HPV18(約占15%)[6-9]，HPV不能在體外經組織進行增殖培養，相應的抗原及抗體來源相對缺乏，使得有關HPV血清學檢測方法的研究也因此相對比較滯后[10]，本研究利用蛋白原核表達和細胞融合技術制備HPV16E6、18E6特異性單克隆抗體，對HPV16、HPV18型別感染者的快速檢測和診斷打下物質基礎。

1 材料與方法

1.1實驗材料 BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6工程菌株由本實驗室前期構建；本實驗室自備SP2/0細胞株；SPF級BALB/C小鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。

1.2儀器與試劑 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導劑、次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培養基、次黃嘌呤-胸腺嘧啶核苷(HT)培養基、融合誘導劑PEG4000由美國MERK公司提供；卡那霉素由上海生工生物工程公司提供；小鼠抗His-Tag單克隆抗體、弗氏完全佐劑和不完全佐劑由美國Sigma公司提供；胎牛血清、1640培養基、青霉素、鏈霉素由美國Hiclone公司提供； BCA蛋白濃度測定試劑盒由碧云天公司提供；HPV E6、HPV16E6、18E6蛋白由上海滬震實業有限公司提供；HR40-Ⅱ A2生物安全柜由青島海爾特種電器有限公司提供；MCO-18AIC二氧化碳培養箱由三洋電機株式會社提供；超聲破碎儀JY-250由浙江省三門超聲波儀器廠提供；JS POWER-300電泳儀由上海培清科技有限公司提供；羊抗鼠IgG-HRP、Mulitskan MK3酶標儀由賽默飛世爾科技公司提供；96孔酶標板、96孔細胞培養板由美國Corning公司提供；His Trap FF親和層析柱購自美國GE Healthcare公司。

1.3HPV16E6、18E6蛋白在大腸桿菌中的表達、純化及定量

1.3.1HPV16E6、18E6基因誘導表達 BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6工程菌株在瓊脂平板(含卡那霉素50 μg/mL)涂板活化后挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養基(含卡那霉素 50 μg/mL)培養過夜，之后取菌液1∶100稀釋作擴增培養至OD值為1.0，以終濃度為0.2 mmol/L IPTG誘導過夜后收集菌液。誘導產物作十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分析,以稀釋度為1∶2 000的小鼠抗His-Tag單克隆抗體作為一抗，稀釋度為1∶2 000的羊抗鼠IgG-HRP為二抗作蛋白質免疫印跡法(Western blot)鑒定。

1.3.2HPV16E6、18E6重組蛋白的純化及定量 收集誘導后菌液離心取沉淀，超聲破碎菌體，取超聲破碎后懸液的上清和沉淀同時進行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍染色、脫色，觀察是否在20×103、22×103的位置出現蛋白質條帶，以確定重組蛋白以可溶性形式存在于超聲裂解上清中。按照His Trap FF親和層析柱使用說明書進行純化操作，對純化前和純化后的產物分別進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分析，考馬斯亮藍染色、脫色，分析純化效果。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒對純化后蛋白進行定量分析。

1.4HPV16E6、18E6蛋白單克隆抗體制備及其鑒定 以純化的HPV16E6、18E6重組蛋白為免疫原免疫6～8周的BALB/c 小鼠。以HPV16E6、18E6蛋白作為抗原分別包被96孔酶標板，1∶10 000稀釋度的HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗間接酶聯免疫吸附測定(ELISA) 法測定BALB/c 小鼠血清抗體效價；以HPV E6抗原包被96孔酶標板，1∶10 000稀釋度的HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗間接ELISA 法測定BALB/c 小鼠血清腹腔積液效價。取免疫鼠脾細胞與SP2/0細胞作細胞融合實驗。采用以HPV16E6、18E6抗原分別包被96孔酶標板，1∶10 000稀釋度的HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗間接ELISA 法篩選融合的陽性雜交瘤細胞，有限稀釋法對陽性細胞進行單克隆增殖培養，以獲取可穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。Western blot對單克隆抗體進行鑒定，提取蛋白質并進行SDS-PAGE電泳、轉膜，以抗His-Tag單克隆抗體作為一抗、羊抗鼠IgG-HRP為二抗，按照產品書進行孵育，ECL顯色液顯色。分析觀察是否在20×103、22×103位置出現特異性條帶。

2 結 果

2.1HPV16E6、18E6重組蛋白表達、純化及定量結果 BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6 誘導和純化后進行SDS-PAGE電泳，鑒定結果見圖1，在誘導后出現相對高濃度的蛋白條帶，并伴有雜帶，在純化后雜帶消失。將IPTG誘導后進行 Western blot鑒定，結果顯示，與BL21相比，HPV16E6、18E6在20×103、22×103處有明顯條帶，說明所誘導的表達蛋白即為目的蛋白，見圖2。對所獲得的蛋白質進行濃度測定，測得吸光度為0.650，根據本實驗室繪制的標準蛋白濃度測定曲線，計算得出目的蛋白濃度為0.25 mg/mL。見圖3。

2.2HPV16E6、18E6蛋白單克隆抗體制備及其鑒定結果 血清抗體效價測定結果顯示HPV16E6 免疫后小鼠血清1∶16 000 稀釋后高達1.219，見表1。

2.2.1腹腔積液效價測定 間接ELISA法檢測結果顯示，腹腔積液在作1∶512 000稀釋后OD值仍高達0.937，效價高達106。

注：M為DNA標記物； 1為BL21 未誘導； 2為BL21誘導后；3為BL21-PET28a-16E6未誘導；4為BL21-PET28a-18E6未誘導；5為BL21-PET28a-16E6誘導后；6為BL21-PET28a-18E6誘導后；7為HPV 16E6純化后；8為HPV 18E6純化后

圖1誘導表達蛋白的SDS-PAGE電泳分析

2.2.2細胞融合后陽性克隆篩選 脾細胞與骨髓瘤細胞融合后經篩選共得到3株陽性雜交瘤細胞。其中兩株可分泌抗HPV16 抗體，分別命名為HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2；1株可分泌抗HPV18 抗體，命名為HPV18E6-3-H1，其中中間數字代表96孔板序號，后字母加數字代表在96孔板的位置，細胞培養液吸光度(A450，參考波長630 nm)分別為0.995、1.003、1.012。

2.2.3陽性克隆鑒定 以BL21、BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6為抗原，收集雜交瘤細胞HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2、HPV18E6-3-H1培養液為一抗，HRP標記羊抗鼠IgG為二抗，進行Western blot,結果顯示雜交瘤細胞HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2分泌抗體可特異性與HPV16E6結合，見圖4，HPV18E6-3-H1分泌抗體可特異性與HPV18E6結合，見圖5。

注：M為DNA標記物；1為BL21；2為HPV16E6；3為HPV18E6

圖2 HPV16E6、HPV18E6 Western blot鑒定

圖3 HPV16E6、18E6蛋白標準曲線

蛋白類型1∶2 0001∶4 0001∶8 0001∶16 0001∶32 0001∶64 000空白對照HPV16E62.2901.7621.5001.0110.5530.3230.063HPV18E62.1231.7811.2190.7470.4670.2630.066

注：M為DNA標記物；1為BL21；2為BL21-PET28a-16E6(HPV16E6-2-G9)；3為BL21-PET28a-16E6(HPV16E6-2-F2)

圖4抗HPV16E6單克隆Western blot鑒定

注：M為DNA標記物； 1為BL21； 2為HPV18E6(HPV18E6-3-H1第1次) ； 3為HPV18E6(HPV18E6-3-H1第2次)

圖5抗HPV18E6單克隆Western blot鑒定

3 討 論

在HPV感染患者中，亞型發生率最高的是HPV16型和HPV18型，這也是我國婦女宮頸癌的主要型別[11-12]。因此，加強對HPV16型和18型感染的檢測對宮頸癌的早發現和早治療具有極其重要的意義。一方面HPV的血清學研究對HPV流行病學研究具有重要價值，但另一方面由于條件限制現在還沒有體外培養HPV的合適方法,所以很難要獲得足夠的HPV天然抗原作為研究材料。原核表達系統具有產量高、費用低廉方面的優勢，通過降低誘導溫度，控制誘導前細菌的濃度、降低誘導時轉速和減少誘導時間可以明顯促進目的蛋白的可溶性表達[13]，同時His標簽不但不會使重組蛋白的生物學活性受到影響，而且還使得蛋白質的純化和檢測步驟更方便。本實驗室通過預先構建的BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a- 18E6轉化菌原核表達獲得了大量的HPV16E6、18E6蛋白，經Western blot鑒定，證實了目的蛋白即是研究者所需要的蛋白。純化的HPV16 E6、18E6融合蛋白作為免疫原免疫小鼠，取小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞作細胞融合，作單克隆培養，有限稀釋篩選出2株分泌抗HPV16 E6及1株分泌抗HPV18E6的抗體，分別命名為HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2、HPV18E6-3-H1。Western blot 檢測所篩選到的抗體，結果顯示HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2只與HPV16型的E6蛋白發生抗原抗體反應，確認是抗HPV16 E6特異性單克隆抗體。 同樣，HPV18E6-3-H1只與 HPV18型的E6蛋白發生抗原抗體反應，確認是抗HPV18 E6特異性單克隆抗體。通過制備小鼠腹腔積液，本實驗成功地獲得了大量的HPV16E6、18E6特異性單克隆抗體，腹腔積液檢測顯示出極高的效價，免疫結果良好。不僅為今后進一步研究HPV16、HPV18的致癌機制，提供了一個重要的實驗資源，而且對HPV16、HPV18感染者的快速檢測和治療將具有重要的實際應用價值。

4 結 論

成功制備抗HPV16E6、18E6單克隆抗體，該抗體效價高，特異度好，為建立血清學診斷方法打下了基礎。