內脂素、CD195、CD30及RORα水平與橋本甲狀腺炎甲狀腺功能減低的相關性分析

袁曉嵐，汪琳姣，王 為，席 巍

(南通大學附屬海安醫(yī)院內分泌科，江蘇南通 226600)

橋本甲狀腺炎(HT)是臨床最為常見的一種慢性淋巴細胞性甲狀腺炎(CLT)，其會導致患者甲狀腺細胞受損，從而發(fā)生甲狀腺功能減退(簡稱甲減)[1]。今年來，隨著人們普遍食用含碘食鹽和生活方式的變化，HT的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢，已經成為原發(fā)性甲減最主要的致病原因，而且HT還與甲狀腺癌發(fā)病率的升高有關[2]。HT的發(fā)病機制較為復雜，與環(huán)境因素、遺傳因素、自身免疫調節(jié)等眾多因素有關，特異性淋巴細胞在抗甲狀腺球蛋白(Tg) 自身免疫啟動后會遷移至甲狀腺，使甲狀腺濾泡細胞(TFC)表達在干擾素-γ(IFN-γ)的誘導下表達大量可導致炎癥反應進一步被放大的組織相容性復合體(MHC) Ⅱ類分子，使甲狀腺組織被具有致活化作用的巨噬細胞、漿細胞、淋巴細胞等大量浸潤，自身免疫反應被激活，導致甲狀腺細胞被破壞[3]。在這一免疫機制中，脂肪因子、細胞因子和淋巴細胞轉錄因子都被認為發(fā)揮了重要的介導和調節(jié)作用。內脂素是一種由脂肪細胞分泌的參與機體糖脂代謝過程的脂肪因子，有研究顯示其有可能還參與了HT患者的免疫調節(jié)過程[4]。維甲酸相關孤核受體α(RORα)是2型固有免疫淋巴細胞(ILC2)的特征性轉錄因子，研究指出,ILC2水平與HT患者Th2細胞活化狀態(tài)密切相關[5]。CD195、CD30為CD4+T淋巴細胞特異性表面因子，二者水平則與甲狀腺局部免疫紊亂情況有關[6]。基于上述研究，筆者則對血清內脂素、細胞因子CD195、CD30及RORα mRNA水平與HT伴甲減至今的相關性進行研究和探討，以進一步明確HT發(fā)病的免疫學機制，進而為臨床免疫學機制干預手段的選擇和應用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年3月至2017年12月在本院接受治療的54例HT伴臨床甲減患者、52例HT甲狀腺功能正常分別作為HT甲減組、HT功能正常組研究對象，選擇同期在本院進行體檢的46名健康志愿者作為健康對照組。HT診斷標準：同時滿足以下3項條件即可確診：(1)甲狀腺彌漫性腫大，經B超證實且無結節(jié)；(2)甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)檢測呈陽性；(3)甲狀腺顯像可見不規(guī)則的稀疏和濃集區(qū)域。以血清游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)水平低于正常低限值，總促甲狀腺激素(TSH)超過正常上限值確定為甲狀腺功能減退。患者均為未接受過甲狀腺激素治療的首診患者。排除標準：(1)存在精神功能障礙者；(2)不符合上述診斷標準者；(3)已接受過相關治療，可能影響本研究結果者；(4)心電圖存在明顯心肌缺血改變或伴有嚴重缺血性心臟病者；(5)存在腎上腺皮質功能異常者；(6)合并嚴重肝、腎功能疾病者；(7)孕婦及哺乳期者。健康對照組志愿者則無高血壓、糖尿病、冠心病、心瓣膜病呼吸系統(tǒng)疾病、神經核精神障礙、腫瘤、甲狀腺疾病、自身免疫性疾病及家族史。HT甲減組中，男15例，女39例；年齡20～70歲，平均(42.15±4.63)歲。HT功能正常組中，男14例，女38例；年齡20～70歲，平均(41.96±5.02)歲。健康對照組中，男10例，女36例；年齡20～70歲，平均(43.01±4.07)歲。3組研究對象性別構成、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核批準，入組患者及健康志愿者知情并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清甲狀腺功能及抗體檢測 抽取所有患者和健康志愿者的清晨空腹靜脈血，靜置30 min后離心機3 000 r/min離心10 min，分離獲取血清，置于-20 ℃冰箱中保存待測。血清FT3、FT4、總三碘甲腺原氨酸(TT3)、總甲狀腺素(TT4)、TSH和血清TGAb、TPOAb、促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)的檢測均采用電化學發(fā)光免疫分析法進行，檢測儀器為德國羅氏診斷有限公司的Cobase 411全自動化學發(fā)光檢測儀，配套試劑盒及質控血清均來自于羅氏公司，嚴格按照說明書要求進行操作。

1.2.2細胞因子CD30、CD195檢測 抽取所有患者和健康志愿者的外周血，應用磷酸鹽緩沖液(PBS)以1∶1比例進行稀釋，取含有等體積淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)的圓底離心管，2 000 r/min離心15 min后收集單個核細胞層，用Hank′s液洗3次，1 500 r/min離心5 min。加入RPMI 1640培養(yǎng)液(美國GibcoBRL公司)調節(jié)細胞濃度為1×106/mL，加入PHA，調節(jié)終質量濃度為100 μg/mL，放置于37 ℃、50 mL/CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后收集細胞，檢測CD30和CD195細胞。用PBS液對收集的細胞進行洗滌重懸，加入藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人CD30(深圳晶美生物工程有限公司)和異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人CD195(深圳晶美生物工程有限公司)，以不加抗體的標本陰性對照。吹吸混勻后置于4 ℃下孵育45 min，PBS液洗滌2次，1 000 r/min離心10 min，殘留液體吸盡，沉淀彈散后在各管中加入1%多聚甲醛PBS 400 μL固定，保存在4 ℃冰箱中，12 h內應用FACS Scan流式細胞儀(美國BD公司)檢測CD30、CD195陽性細胞百分比。

1.2.3RORγ mRNA表達水平檢測 收集外周血單個核細胞后用PBS 10 mL洗滌2次，按照Trizol試劑盒說明書進行總RNA提取。在外周血單個核細胞中加入總RNA提取試劑Trizol 1 mL，吹打混勻后，室溫下放置30 min。加入預冷氯仿200 μL，充分震蕩15 s，室溫下放置20 min，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，收集上層水相，在其中加入異丙醇500 μL，混勻，室溫下放置10 min。4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取下層沉淀用75%無水乙醇1 mL洗滌，4 ℃下2 000 r/min離心10 min，取下層沉淀，室溫下干燥至半透明狀，用無RNA酶的10 μL DEPC水溶解細胞，提取總RNA，采用Ur-2401紫外分光光度計測定RNA樣品的濃度和純度。采用半定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(semiRT-PCR) 法測定外周血RORαmRNA表達水平。應用反轉錄試劑盒進行cDNA合成，操作根據(jù)試劑盒說明書進行，總RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒均購買自大連寶生物工程有限公司。聚合酶聯(lián)反應中應用Primer 5.0進行引物設計，RORα、β-actin mRNA的引物序列為RORα：上游為CTG ACG AGG ACA GGA GTA GG，下游為GTG CGC AGA CAG AGC TAT TC，產物長度為214 bp；人β-actin：上游為5′-TCT ACA ATG AGC TGC GTG TGG-3′，下游，5′-GGA ACC GCT CAT TGC CAA TG-3′，產物長度498 bp。引物序列由上海生工生物工程技術有限公司合成。PCR反應條件：94 ℃下預變性5 min；94 ℃下變性5 s，59 ℃下RORα退火30 s，58 ℃下β-actin退火30 s，72 ℃下延伸30 s，循環(huán)共計35個；72 ℃下保溫5 min。取5 μLPCR產進行1%瓊脂糖電泳和溴化乙啶染色，應用BIO-RAD CheniDOC XRS圖像分析系統(tǒng)讀取條帶灰度值，以目的基因和βactin灰度值比值表示mRNA表達的相對值。

2 結 果

2.1各組甲狀腺功能指標比較 HT甲減組的血清FT3、FT4、TT3、TT4水平均顯著低于健康對照組和HT功能正常組,HT甲減組TSH則顯著高于健康對照組和HT功能正常組(P<0.05)，HT功能正常組與健康對照組間FT3、FT4、TT3、TT4比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2各組自身抗體水平比較 HT甲減組TRAb、TPOAb、TGAb均顯著高于健康對照組和HT功能正常組，HT功能正常組的TRAb、TPOAb、TGAb也顯著高于健康對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3各組血清內脂素、細胞因子及RORαmRNA表達水平比較 HT甲減組血清內脂素、 CD195和CD30 陽性百分比及RORαmRNA表達水平均顯著高于HT功能正常組和健康對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且HT功能正常組和健康對照組血清內脂素、 CD195和CD30 陽性百分比及RORαmRNA表達水平比較差異也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

2.4相關性分析 HT甲減組患者血清內脂素、CD30、CD195陽性百分比、RORαmRNA表達水平均與TSH、TRAb、TGAb、TPOAb呈明顯正相關，與TT4呈明顯負相關(P<0.05)，見表4。

表1 各組甲狀腺功能指標比較±s)

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與HT功能正常組比較，#P<0.05

表2 各組自身抗體水平比較±s)

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與HT功能正常組比較，#P<0.05

表3 各組血清內脂素、細胞因子及RORαmRNA表達水平比較±s)

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與HT功能正常組比較，#P<0.05

表4 Pearson相關性分析

3 討 論

HT是臨床常見的一種可導致甲狀腺功能亢進或減退的甲狀腺疾病，可見甲狀腺腫大或結節(jié)，甲狀腺持續(xù)免疫炎癥持續(xù)進展，最終可導致甲減，出現(xiàn)包括畏寒、疲勞、甲狀腺腫痛、心率減慢、便秘、抑郁等在內的臨床表現(xiàn)，或并發(fā)類風濕性關節(jié)炎、惡性貧血、干燥綜合征等并發(fā)癥，甚至發(fā)生癌變，女性患者多伴有受孕和懷孕困難[7]。流行學研究顯示，HT是導致甲狀腺功能減退的主要病因，其發(fā)病率約為0.1%～10.0%，以女性患者更為常見[8]。HT目前的發(fā)病機制尚不明確，臨床采取的治療方式主要為甲狀腺激素類藥物替代療法，雖然該種療法可明顯緩解患者的甲狀腺腫大，改善其甲狀腺功能，但也存在不良反應多、停藥易復發(fā)等不足，而且無法完全糾正患者的甲狀腺功能減退，隨著病情發(fā)展，多數(shù)患者最終往往需接受手術治療[9]。因此對HT發(fā)病機制的探討有可能為疾病的治療提供新的途徑。

HT患者早期多無臨床癥狀,隨病程進展,出現(xiàn)彌漫性甲狀腺腫大,早期可伴甲狀腺功能亢進(簡稱甲亢),晚期伴甲減。其中甲亢期患者血清TSH輕微升高，血清TT3、TT4及自身抗體TPOAb、TGAb等陽性。后期有甲狀腺組織不斷受到破壞而萎縮，最終發(fā)生甲減，其血清TSH水平顯著升高，F(xiàn)T3、FT4、TT3、TT4水平降低，且血清中TPOAb、TGAb、TRAb持續(xù)陽性[10]。本研究結果顯示,HT甲減組的血清FT3、FT4、TT3、TT4水平均顯著低于健康對照組和HT功能正常組,TSH則顯著高于健康對照組和HT功能正常組，而HT功能正常組患者的相關甲狀腺激素與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；比較其自身抗體水平可見HT甲減組TRAb、TPOAb、TGAb均顯著高于健康對照組和HT功能正常組，HT功能正常組也顯著高于健康對照組。提示甲狀腺功能正常的HT患者甲狀腺激素水平變化不大，而無論甲狀腺功能減退還是正常，HT患者的自身抗體水平均明顯升高。高表達水平的自身抗體可通過補體、抗體依賴細胞介導的細胞毒作用等途徑對甲狀腺濾泡產生損傷作用，從而最終導致甲狀腺功能減退[11]。

HT屬于器官特異性自身免疫性疾病，多種機制參與其發(fā)病過程。B細胞的活化是導致甲狀腺產生抗體的主要原因，而Th2細胞在該過程中發(fā)揮了重要的輔助作用。ILC2是一種固有淋巴細胞，其通過分泌和釋放2型免疫應答細胞因子參與了維持Th2優(yōu)勢分化狀態(tài)的過程，其還對B細胞釋放IgE抗體具有促進作用。而RORα則是特征性的ILC2轉錄因子，其對于ILC2分化和功能的維持意義重大[6]。有學者對HT患者外周血單個核細胞中RORαmRNA的表達水平進行觀察，結果顯示，相對于健康對照者，HT患者RORα表達水平顯著升高，其ILC2細胞活性升高，進一步相關性分析結果顯示，RORαmRNA表達水平與血清自身抗體水平呈現(xiàn)明顯正相關，其指出RORα的表達可通過影響ILC2活性來進一步影響HT患者自身抗體的產生[12]。本研究結果顯示，HT甲減組和HT功能正常組患者的外周血單個核細胞RORαmRNA表達水平顯著高于健康對照組，且HT功能正常組也顯著高于健康對照組，Pearson相關性分析則顯示HT甲減組患者RORαmRNA表達水平均與TSH、TRAb、TGAb、TPOAb呈明顯正相關，與TT4呈明顯負相關。提示RORα的表達水平與HT患者甲狀腺功能減退和自身抗體水平密切相關。

CD30、CD195是CD4+T淋巴細胞的特異性表面因子，其中CD30是Th2細胞的優(yōu)勢細胞因子，CD195是Th1細胞的優(yōu)勢細胞因子，二者表達水平的變化可對甲狀腺局部Th1、Th2平衡產生影響，可反映出甲狀腺局部免疫狀態(tài)。作為Th2細胞的代表性細胞因子，CD30水表達水平的升高提示體液免疫活躍，在哮喘、Graves病患者中均可見CD30的優(yōu)勢表達[13]。CD195又名CCR5，屬于調節(jié)性T細胞(Treg)趨化因子受體家族，主要表達于單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞中，參與免疫狀態(tài)穩(wěn)定的維持。有研究指出，CD195的高水平表達是誘發(fā)HT細胞免疫的重要因素[14]。本研究結果顯示，HT甲減組和HT功能正常組患者的CD30、CD195陽性百分比均顯著高于健康對照組，且HT功能正常組也顯著高于健康對照組，Pearson相關性分析則顯示HT甲減組患者CD30、CD195陽性百分比均與TSH、TRAb、TGAb、TPOAb呈明顯正相關，與TT4呈明顯負相關。提示HT患者的甲狀腺功能減退與CD30、CD195異常表達而導致細胞免疫活躍有關。

內脂素是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有模擬胰島素作用的脂肪因子，同時也是一個促炎癥反應因子，具有炎癥和免疫特性，在人體獲得性免疫和固有免疫系統(tǒng)的調節(jié)中具有非常重要的作用。內脂素可對樹突狀細胞和巨噬細胞的活化狀態(tài)產生調控，其可誘導T細胞分化為Th2細胞，使輔助B細胞成熟的白介素(IL)-4、IL-5、IL-6等釋放增多，從而促進自身抗體產生，介導體液免疫。有研究指出，內脂素水平與甲狀腺功能密切相關，當甲狀腺功能減退時，體內脂肪組織蓄積，脂肪細胞合成分泌內脂素增加，其血清濃度相應升高，而且其血清濃度與甲狀腺功能異常患者血清甲狀腺激素水平有關[15]。本研究結果顯示，HT甲減組和HT功能正常組患者的血清內脂素水平顯著高于健康對照組，且HT功能正常組也顯著高于健康對照組，Pearson相關性分析則顯示HT甲減組患者內脂素與TSH、TRAb、TGAb、TPOAb呈明顯正相關，與TT4呈明顯負相關。提示內脂素水平的升高與HT患者甲狀腺激素水平的變化和自身抗體水平水平升高有關，但有關其在HT甲狀腺功能減退中的價值仍需進一步研究明確。

綜上所述，HT甲減患者的血清內脂素、細胞因子CD30、CD195陽性百分比及RORα表達水平均顯著升高，其與患者的甲狀腺功能及自身抗體水平具有一定的相關性，其作用可能是通過影響調節(jié)性 T 細胞趨化因子受體水平和Th2 細胞因子表達，導致自身免疫反應被激活，引起甲狀腺細胞破壞，從而最終導致患者發(fā)生甲狀腺功能減退。