CTLA-4+細胞在急性加重慢性阻塞性肺疾病患者外周血中的表達

常 芬

(武漢市普仁醫院呼吸內科，湖北武漢 430081)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以持續性氣流受限為特征的呼吸系統疾病[1]。作為一種不完全可逆的氣流受限而進行性發展的慢性病，吸煙、遺傳及個體易感等多種因素通常被認為與COPD的發生、發展相關，而且隨著現代社會的發展及環境污染的日益嚴重，影響COPD發生、發展的因素也變得多樣[2]。從病理及免疫學的角度出發，呼吸道縮窄阻塞的過程通常與一系列復雜的由吸入顆粒物及有害氣體所引起的慢性炎性反應密切相關，黏膜下多種炎癥細胞浸潤及細胞、體液免疫不同程度的改變使氣流阻塞成進行性發展[3]。而且COPD的發生、發展過程中會合并嚴重的并發癥，如肺癌、心腦血管疾病、糖尿病等，因此，COPD已成為威脅人民身體健康及生活質量的重要疾病[4-5]，成為受社會廣泛關注的健康問題。

曾有相關研究指出，COPD患者1型輔助性T細胞(Th1)的免疫應答在COPD患者中受限，Th1細胞主要通過釋放γ干擾素 (IFN-γ) 活化巨噬細胞，增強其殺傷已被吞噬的病原體的能力。細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)又名CD152，是一種白細胞分化抗原，是T細胞上的一種跨膜受體，與CD28共同享有B7分子配體，而CTLA-4與B7分子結合后誘導T細胞無反應性，參與免疫反應的負調節。調節性T細胞(Tregs)可以持續表達CTLA-4并以此影響效應T細胞。有研究表明，COPD患者的CTLA-4+T細胞及CTLA-4+Treg細胞顯著高于健康人[6]，因此，本次研究假設CTLA-4+表達過度是Th1細胞免疫功能障礙的關鍵環節，并最終導致COPD患者肺部受到細菌性感染，并找到COPD患者Th1細胞功能障礙的關鍵免疫調節環節，進一步尋找改善患者Th1細胞功能的方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2017年1月于本院收治的40例急性加重慢性阻塞性肺疾病(AECOPD)且無肺部細菌性感染的患者作為病例組，同時選取40例平穩期慢性阻塞性肺疾病(sCOPD)患者作為對照組。入選標準：(1)所有受試者均依照中華醫學會《慢性阻塞性肺疾病診治指南》確診[7]；(2)穩定期的判斷均按照中華醫學會呼吸病學分會及原衛生部醫政司相關指南及診療規范要求[7]；(3)AECOPD患者除需滿足前文所述納入標準外，需經痰培養確認未合并肺部細菌性感染。排除標準：(1)合并肝臟、心臟、腎臟及血液系統疾病；(2)本研究前2周使用過免疫抑制劑的患者；(3)本研究前2周使用過全身激素的患者。被納入本次研究的所有研究對象均為漢族，其中AECOPD組男性患者24例，女性患者16例；sCOPD組男性患者22例，女性患者18例。納入的研究對象人口學特征在組間分布均衡可比。本研究經本院倫理委員會討論通過，所有患者均知情且自愿參加，并簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1血漿分離制備 對所有研究對象取新鮮外周血，并3 000 r/min離心10 min，上層血清用移液槍吸入EP管中置于超低溫冰箱-80 ℃保存待統一酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測。將需檢測血清從冰箱中取出常溫下自然化凍后使用檢測試劑檢測血清樣本中目標成分的水平，使用多功能酶標儀檢測。分離后的血漿單核細胞(PBMC)置于10%的胎牛血清中。

1.2.2CTLA-4+細胞比例測定 取sCOPD組及AECOPD組等量PBMC及加入胎牛血清后在37 ℃、5% CO2的條件下傾斜靜置24 h，再過2 h加入布雷菲德菌素(1 μg/mL)或莫能菌素(2 μmol/L)加上CTLA-4別藻藍蛋白抗體，以便檢測細胞內及細胞外CTLA-4。清洗細胞后用Fixable Viability Stain 450、CD3-APC-H7、CD4-V500、CD8-Peridinin chlorophyll protein-Cy5.5及CD45RAphycoerythrin-Cy7進行細胞表面著色；同時應用Human Foxp3 buffer sets、Foxp3-phycoerythrin 及CTLA-4-APC抗體進行細胞內染色，后用流式細胞儀進行分析。

1.2.3抗CTLA-4抗體阻斷 取等量sCOPD組及AECOPD組PBMC各一份加入抗CD3抗體，再取等量AECOPD組PBMC一份加入抗CD3抗體及抗CTLA-4 抗體，將3份PBMC樣本置于96孔平板培養24 h，上層培養物轉移并儲存在-80 ℃ 冰箱中存儲，取出培養物后經自然化凍并應用ELISA法檢測其中IFN-γ及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.2.4儀器與試劑 本次研究所使用的離心機為邁達TDM3-120m；檢測血清生物標志物所使用的多功能酶標儀為安圖斯-PHOMO；流式細胞儀為賽默飛生產的Attune NxT；布雷菲德菌素及莫能菌素來源于BD公司生產的GolgiPlug產品；CTLA-4-APC及Foxp3-phycoerythrin均為 BD公司生產；進行細胞內CTLA-4染色使用的Fixable Viability Stain 450為BD公司生產的Horizon產品；Human Foxp3 buffer sets為BD公司生產的Pharmingen產品；用于細胞培養的抗CD3抗體為Mabtech公司生產；TNF-α的ELISA檢測試劑由BD公司生產(557966)；IFN-γ的ELISA檢測試劑由Cusabio公司生產(E04577h)。在整個研究過程中，所有操作均按照說明書嚴格執行，并且所有操作均符合實驗室的質量控制標準。

2 結 果

2.1兩組患者人口學特征及基礎狀況分析 對sCOPD組與AECOPD組的人口學特征及基線情況分析發現，兩組患者性別、年齡及吸煙比例等人口學特征組間差異無統計學意義(P>0.05)。而標志著系統炎癥的血清高敏C反應蛋白(hs-CRP)及血清可溶性腫瘤壞死因子受體1(sTNFR1)水平在兩組間的差異有統計學意義(P<0.05)，AECOPD患者的血清hs-CRP值及血清sTNFR1值均高于sCOPD患者。見表1。

表1 兩組患者人口學特征及基礎狀況分析

注:*表示對數轉換后服從正態分布

2.2兩組患者CTTLA-4+細胞比例分析 對兩組患者外周血細胞的分析可以看出，sCOPD患者Treg細胞在所有CD4+細胞中的比例為4.35%；AECOPD患者Treg細胞在所有CD4+細胞中的比例為5.12%，兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。sCOPD患者細胞內CTLA-4+細胞在Treg細胞及CD4+細胞的比例分別為54.47%和8.13%；AECOPD患者細胞內CTLA-4+細胞在Treg細胞及CD4+細胞的比例分別為50.14%和7.61%，兩組間差異均無統計學意義(P>0.05)。sCOPD患者表面CTLA-4+細胞在Treg細胞及CD4+細胞的比例分別為8.69%和1.08%；AECOPD患者表面CTLA-4+細胞在Treg細胞及CD4+細胞的比例分別為20.74%和2.31%，兩組間差異均有統計學意義(P<0.05)。AECOPD患者表面CTLA-4+在Treg細胞及CD4+細胞中所占比例均高于sCOPD患者。見表2。

2.3兩組患者PBMC經不同方式培養后血清中IFN-γ及TNF-α水平分析 對兩組患者PBMC分別加入抗CD3抗體，另取等量AECOPD患者血清加入抗CD3抗體+抗CTLA-4抗體分別培養后測定培養物中IFN-γ及TNF-α水平，發現3組培養物的IFN-γ水平不全相同(P<0.05)。進一步用SNK-q法進行兩兩比較發現，AECOPD患者PBMC中僅加入抗CD3抗體后獲得的培養物中IFN-γ水平顯著低于sCOPD患者PBMC中僅加入抗CD3抗體及AECOPD患者PBMC中加入抗CD3抗體+抗CTLA-4抗體所獲得的培養物中IFN-γ水平，而AECOPD患者PBMC中加入抗CD3抗體+抗CTLA-4抗體所獲得的培養物中IFN-γ水平與sCOPD患者PBMC中僅加入抗CD3抗體所獲得的培養物中IFN-γ水平間差異無統計學意義(P>0.05)。同時，通過比較發現3組培養物的TNF-α水平不全相同(P<0.05)。進一步兩兩比較發現,AECOPD患者PBMC中僅加入抗CD3抗體后獲得的培養物中TNF-α水平顯著低于sCOPD患者PBMC中僅加入抗CD3抗體及AECOPD患者PBMC中加入抗CD3抗體+抗CTLA-4抗體所獲得的培養物中TNF-α水平，而AECOPD患者PBMC中加入抗CD3抗體+抗CTLA-4抗體所獲得的培養物中TNF-α水平與sCOPD患者PBMC中僅加入抗CD3抗體所獲得的培養物中TNF-α水平間差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 兩組患者CTTLA-4+細胞比例分析

注：*表示Wilcoxon秩和檢驗

表3 兩組患者PBMC經不同方式培養后血清中IFN-γ、TNF-α水平分析

續表3 兩組患者PBMC經不同方式培養后血清中IFN-γ、TNF-α水平分析

注：*表示對數轉化后服從正態分布

3 討 論

有研究顯示，AECOPD的患者合并有細菌感染的比例高達50%，這常常導致病情復雜化并使患者治療難度增加，對患者病情的控制十分不利[8-9]。病原分離的結果提示，未分型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和莫拉克斯菌屬是造成AECOPD患者肺部感染的主要病原體[10-11]。值得注意的是，有研究報道口服未分型流感嗜血桿菌疫苗無法阻止AECOPD患者肺部受到未分型流感嗜血桿菌的感染；同時，AECOPD患者氣道浸潤的大量活化T細胞同樣對AECOPD患者的肺部感染無能為力；而且經痰培養確診的肺部合并不可分型流感嗜血桿菌(NTHI)感染的AECOPD患者對NTHI P6蛋白的淋巴增殖反應低于不合并NTHI感染的COPD患者[12]。以上事實均說明AECOPD患者的呼吸道免疫功能受到限制。雖有研究證實該現象與COPD患者急性加重期的Th1細胞功能障礙有關[13-14]，但是關于其中的機制性研究還比較匱乏。通過本次研究，可以說明表面CTLA-4+細胞有限制AECOPD患者Th1細胞功能的作用。如果進一步阻斷表面CTLA-4+的表達，Th1細胞功能將有所恢復并且血清中IFN-γ與TNF-α的水平均有顯著提高。

從sCOPD患者及AECOPD患者外周血PBMC中CTTLA-4+細胞比例分析結果可知，sCOPD患者細胞內CTLA-4+細胞在Treg細胞及CD4+細胞的比例與AECOPD患者細胞內CTLA-4+細胞在Treg細胞及CD4+細胞的比例十分接近；而表面CTLA-4+則不然，sCOPD患者表面CTLA-4+細胞在Treg細胞及CD4+細胞的比例分別為8.69%和1.08%；AECOPD患者表面CTLA-4+細胞在Treg細胞及CD4+細胞的比例分別為20.74%和2.31%，兩組間差異均有統計學意義(P<0.05)。因此，COPD患者急性加重期的Th1細胞功能障礙主要與表面CTLA-4+細胞相關，而非細胞內CTLA-4+細胞，這與其他相關研究所得結論一致[6，15]。而且高比例的表面CTLA-4+也會造成AECOPD患者血清sTNFR1水平高于sCOPD患者。而細胞內CTLA-4+通常與COPD患者呼吸道的長期慢性炎癥相關，因此，在兩組間未見顯著差別。

從基因的角度來看，CTLA-4基因的剪切變異體可以使CTLA-4的跨膜異構體及不能跨膜轉移的可溶性異構體表達增加[16]。兩種異構體均可由活性CD4+細胞誘導并抑制免疫反應。由于本次研究所使用的抗CTLA-4抗體可以阻斷跨模性及可溶性兩種異構體的免疫活性。因此，尚需進一步使用針對兩種異構體的特異性阻斷抗體進行試驗以獲得進一步的結論。這也是下一步研究的重點。

本次研究結果顯示，IFN-γ的水平與CTLA-4+細胞比例呈反比例關系，在加入抗CTLA-4抗體的AECOPD組中IFN-γ的水平有顯著升高，提示抗CTLA-4抗體的加入可以恢復Th1細胞的免疫功能。因此，可以降低AECOPD患者肺部細菌性感染的風險，這一結論可以為COPD急性加重時患者的治療產生有益的提示。