北京地區婦科門診患者沙眼衣原體和人類乳頭瘤病毒感染及其基因型相關分析

洪 萍，王培昌，劉 宇，蘭 賀

(首都醫科大學宣武醫院檢驗科，北京100053)

人類乳頭瘤病毒(HPV)感染是導致宮頸癌發生的一個重要因素[1-2]。而只有持續的HPV感染并且存在其他促進感染的協同因素存在時，才有可能引起宮頸癌的發生，大部分HPV感染都能被宿主的免疫反應清除[3]。已有研究表明宮頸癌的發生與其他的性傳播疾病及HPV有關，這些性傳播疾病的感染可能是宮頸癌發生的協同因素[4-5]。沙眼衣原體(CT)是影響人類生殖健康的重要病原體之一。CT能夠引起前列腺炎和尿道炎等疾病，是引起男性不育的重要原因之一，其抗體存在與否與HPV感染狀態及宮頸癌的進展都有一定的聯系[3]，婦女感染CT增加了患宮頸癌的風險[6]。不同的人種和地區其HPV感染的基因型分布是有區別的[7]，目前國內關于CT和HPV感染及HPV基因型相關研究報道的比較少。本研究對2017年12月至2018年12月首都醫科大學宣武醫院婦科門診患者行CT及HPV檢測結果進行了回顧性分析及比較，旨在研究CT和HPV感染及HPV基因型的相關性，為制定合理的預防、檢測及治療方案提供依據?，F將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年12月至2017年12月在首都醫科大學宣武醫院婦科門診因生殖道感染就診患者1 768 例，平均年齡(30±10)歲，收集患者的相關臨床信息。納入病例標準：(1)在本院婦科門診因生殖道感染就診患者；(2)HPV分型及CT檢測均在本院進行；(3)既往無子宮切除史、宮頸手術史及HPV感染治療史；(4)無盆腔放射治療史； 排除病例標準：(1)患者病例資料不完整；(2)月經期或嚴重內外科疾病無法配合檢查的患者；(3)標本細胞量過少或標本不合格者。

1.2基因分型 (1)單一HPV陽性組根據HPV是否為單一亞型，分為單一亞型和多重亞型；(2)單一HPV陽性患者根據HPV基因型，分為不同基因亞型；(3)HPV和CT合并感染患者根據是否為單一亞型，分為單一亞型和多重亞型；(4)HPV和CT合并感染患者根據HPV基因型，分為不同基因亞型。

1.3儀器與試劑 CT、HPV核酸檢測試劑盒(廣東潮州凱普生物化學有限公司)，BIOER lifeExpress 聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀(杭州博日科技有限公司)，Hybrimax醫用核酸分子快速雜交儀(廣東潮州凱普生物化學有限公司)，Lightcycle 480(德國羅氏)。

1.4方法

1.4.1標本采集及保存方法 用無菌棉拭子將宮頸口過多的分泌物輕輕擦拭干凈，更換宮頸刷，將其置于宮頸口，輕輕順時針旋轉5周，所有標本置已加有專用細胞保存液-液基薄層細胞學(TCT)保存液的取樣管內，擰緊瓶蓋，立即送檢。

1.4.2DNA提取 取含有宮頸細胞的細胞保存液0.6 mL，按照凱普生物化學有限公司的細胞裂解液說明書步驟提取DNA。

1.4.3PCR導流雜交HPV分型檢測 (1)PCR擴增 ： 按照說明書配置體系并進行PCR擴增。 每個PCR反應孔中加入PCR混合液23.25 μL[含脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、氯化鎂(MgCl2)、Tris-HCl緩沖液]，DNA聚合酶0.75 μL及 DNA樣本1 μL，按說明書配置對應空白對照及陽性對照。按照95 ℃/9 min預變性，95 ℃/20 s變性，55 ℃/30 s退火及72 ℃/30 s延伸，40個循環。(2)雜交及結果判定：取PCR擴增產物進行膜雜交，操作按說明書進行，結果出現清晰可見藍紫色原點為陽性。該試劑盒可檢測21種HPV基因型，其中15種高危型(HR)16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68，6種低危型(LR)6、11、42、43、44，CP8304，并在1 h內分析結果。

1.4.4熒光PCR檢測CT (1)熒光PCR擴增：按照說明書進行配置體系并進行熒光PCR擴增。每個PCR反應孔中加入PCR混合液17.5 μL(含dNTP、MgCl2、Tris-HCl緩沖液)，DNA聚合酶0.5 μL及 DNA樣本2 μL，按說明書配置對應空白對照及陽性對照。按照95 ℃/10 min預變性，95 ℃/15 s變性，60 ℃/60 s退火及延伸，45個循環，采集熒光，進行Ct值計算。(2)結果判定:嚴格按照說明書進行，根據患者Ct值判定陰陽性結果。當臨床樣本的Ct值≤40，判為陽性，否則為陰性。

1.5統計學處理 采用SPSS19.0進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1HPV和CT檢測結果 在1 768例婦科門診樣本中，CT陽性者196例，總陽性率為11.1%(196/1 768)。HPV陽性者524例，總陽性率為29.6%(524/1 768)，所有21種HPV基因亞型均有檢出，其中HPV單一亞型者414例(79.0%)，多重亞型者110例(21.0%)。524例HPV陽性樣本中，有122例CT檢測陽性，陽性率23.3%(122/524)。在122例合并感染中，HPV單一亞型者48例(39.3%)，多重亞型者74例(60.7%)。HPV合并CT感染患者多重亞型HPV陽性率明顯高于單一亞型HPV陽性率，而單一HPV感染患者HPV陽性率高于HPV合并CT感染患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同感染類型HPV陽性率分布情況

注：*P<0.05，χ2=175.6，與HPV合并CT感染類型比較；**P<0.05，χ2=150.8,與單一亞型比較

2.2不同感染類型患者HPV的基因型分布情況 122例HPV合并CT感染患者和402例單一HPV感染患者 HPV基因型分布情況見圖1。122例HPV合并CT感染患者共檢測出270個基因型，而402例單HPV感染患者共檢測出474個基因型，感染前4位的HPV基因亞型由高到低依次為HPV-16、52、58、33；各型在HPV合并CT感染患者中陽性率都高于單一HPV 感染患者，見圖1、表2。

圖1 不同感染類型患者HPV基因型分布情況

HPV亞型單一HPV感染HPV合并CT感染χ2P1625(5.3)40(14.8)19.6<0.055222(4.6)36(13.3)18.1<0.055817(3.6)31(11.5)17.8<0.053311(2.3)23(8.5)15.2<0.05合計75(15.8)130(48.1)90.0<0.05

2.3不同感染類型患者單一亞型和多重亞型感染HPV的基因型分布 122例HPV合并CT感染患者和402例單一HPV感染患者單一亞型和多重亞型HPV感染基因型分布見圖2。在單一亞型感染中，HPV合并CT感染患者48例，單一HPV感染患者96例，且單一HPV感染陽性率除HR-HPV 66外，均高于HPV合并CT感染陽性率，見圖2A。在多重亞型感染中，感染前4位的HPV基因亞型由高到低依次為HPV-16、52、58、33，見圖2B；HPV合并CT感染患者多重亞型的陽性率都高于單一HPV感染患者，見表3。

表3 不同感染類型患者單一亞型和多重亞型感染HPV基因型分布[n(%)]

注：A表示單一亞型；B表示多重亞型

圖2 HPV合并CT感染和單一HPV感染患者基因型分布情況

3 討 論

目前文獻報道HPV有近40種亞型跟生殖道感染相關，根據誘發宮頸癌發生的危險程度的不同，分為HR-HPV和LR-HPV兩大類，且不同HPV亞型的感染其致病性和后果也有差異[8-9]。因而，不同地區和人群HPV亞型感染的分布資料，是HPV感染和宮頸癌防治策略的基礎。本研究通過對1 768例婦科門診患者進行分型篩查，結果顯示HPV總陽性率為 29.6%(524/1 768)，其中HPV單一亞型者 414例(414/524，79.0%)，多重亞型者110 例(110/524，21.0%)。

HPV的感染已被證實為導致宮頸癌的主要致病因素，但并不是所有HPV感染最終都會演變為宮頸癌，CT感染影響宿主自身感染HPV的狀態也成為導致宮頸癌的一個重要因素[10]。有研究報道，沙眼衣原體的感染可以導致機體免疫清除能力的減低[3]，從而增加了宿主感染HPV的概率。在本研究中，CT的總陽性率為 11.1%(196/1 768)，而HPV合并CT感染患者為122例(23.3%)，且HPV合并CT患者HPV陽性率明顯高于單一HPV感染患者，差異有統計學意義(P<0.05)，該結果證實CT感染是HPV感染的協同因素。

在HPV基因型分布的研究中，122例HPV合并CT感染患者中，單一亞型為39.3%(48/122)，多重亞型高達60.7%(74/122)，共檢測出270各基因型。HPV單一亞型主要分布在單HPV感染的患者中，而HPV合并CT感染患者HPV多重亞型的陽性率明顯高于單一HPV感染患者，差異有統計學意義(P<0.05)，該研究結果表明CT感染有可能會促進HPV多重亞型感染的發生。SERACENI等[11]指出，單一亞型HPV感染一般不會促進機體進一步感染的可能，而多重亞型HPV感染可能會導致免疫系統局部損傷。CT感染可能導致HPV多重亞型陽性率升高，對機體免疫系統造成破壞，最終提高宮頸癌發生的危險性。本研究發現，HPV合并CT感染患者的HR-HPV16、52、58、33比單一HPV感染患者總體陽性率更高，差異有統計學意義(P<0.05)，多重亞型感染患者與此總體陽性率分布結果一致。已有文獻報道HR-HPV16在HPV合并CT 感染患者中陽性率最高，CT感染有可能提高HPV16在低度鱗狀上皮內病變的蛋白表達，提高HPV的活性[3,12]。因此，CT感染會增加HPV多重感染的風險，從而提高HPV合并CT感染著宮頸癌變的風險。

4 結 論

從CT感染患者中HPV尤其多重亞型及HR-HPV高陽性率了解到對于檢測出HPV感染的婦女，有必要進行CT的檢測，若兩者均為陽性，臨床應予以重視，并進行及時針對性治療，從而更好的防治HPV感染和宮頸癌的發生。