微滴數字PCR檢測含有目的基因的PUC57質粒問題分析

楊德平，劉維薇

(1.上海健康醫學院附屬周浦醫院檢驗科，上海 201318；2.上海市同濟大學附屬第十人民醫院檢驗科，上海 200072；3.上海市皮膚病醫院檢驗科，上海 200070)

近年來，微滴數字聚合酶鏈反應(ddPCR)作為新一代PCR，具有高靈敏度、高精密度和高準確度，使它在檢測體細胞稀有等位基因突變或低濃度的DNA樣本時比傳統的實時熒光定量PCR(qPCR)更加可靠和適用[1]。它使用絕對定量取代標準曲線，已作為一種替代方法廣泛用于臨床和醫學研究[2-4]。該方法依賴于對傳統PCR反應有限的稀釋和泊松統計[2,5]。在有限的稀釋后，大多數反應不包含或僅包含一個靶分子，并且每個反應是獨立的測試。通過泊松統計計算出有熒光信號的比值，最后得出樣本中的絕對模板量[6-7]。PUC57質粒是大腸桿菌載體含有2 710 bp。本實驗利用ddPCR檢測含有目的基因的PUC57質粒，對檢測過程中出現的酶切、酶切孵育時間和酶切后放置天數的問題進行了探討，為同行提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 根據GenBank中乙肝病毒DNA(HBV DNA)的序列，經過序列比對分析，針對HBV DNA保守區設計引物和探針，用引物擴增的那段目的基因片段(95 bp)構建PUC57質粒，質粒的構建由上海生工生物工程有限公司完成。質粒含有2 806 bp，質粒的濃度為237 ng/μL，通過換算為7.82×1010copies/μL。為獲得線性DNA模板，用ECORⅠ酶對PUC57質粒進行酶切。酶切好的質粒放在2～8 ℃冰箱保存待用。

1.2儀器與試劑 ECORⅠ酶、10×ECORⅠ buffer購自上海生工生物工程有限公司，ddPCR試劑及其耗材購自美國Bio-Rad公司。QX200TM微滴生成儀、PX1TMPCR板封口機、QX100TMPCR儀、QX200TM微滴讀取儀購自美國Bio-Rad公司。DH100-2恒溫金屬浴購自杭州瑞誠儀器有限公司。

1.3引物與探針 通過序列比對分析，針對HBV DNA保守區設計的引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成，5′→3′引物探針序列為F:TAG ACC ACC AAA TGC CCC TA；R:GAG GCG AGG GAG TTC TTC TT；探針:FAM-ACT GTT GTT AGA CGA CGA GGC AGG TCC-BHQ1。

1.4酶切 將含有目的基因的PUC57質粒與ECORⅠ試劑按比例進行混合，放入37 ℃恒溫金屬浴中孵育，為了使酶切后的質粒通過ddPCR檢測后所得值與質粒理論值相符，研究者用了2個孵育時間，一份混合物孵育2 h，另一份混合物孵育4 h，在孵育的時間到達后，每份混合物再65 ℃孵育20 min，滅活ECORⅠ酶，酶切總體積為20 μL(包括ECORⅠ 1 μL、10×buffer 2 μL、PUC57質粒4 μL、ddH2O 13 μL)。酶切得到的線性DNA模板再用ddH2O稀釋成100、101、102、103copies/μL，稀釋的模板用于ddPCR檢測。最后比較兩個孵育時間后，酶切混合物經過ddPCR檢測所得值與質粒理論值差異有無統計學意義。

1.5ddPCR檢測 按照儀器操作指南，反應體系為20 μL，其中ddPCR Supermix 10 μL，上下游引物(900 nmol/L)各1 μL，探針(250 nmol/L)0.3 μL，質粒4 μL，ddH2O 3.7 μL。使用QX200TM微滴生成儀生成微滴，然后用PX1TMPCR板封口機熱封96孔板，最后使用QX100TMPCR儀對含有目的基因的PUC57質粒進行擴增，反應條件為：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 60 s，35個循環；98 ℃ 10 min；4 ℃保存。擴增結束后將96孔板放入QX200TM微滴讀取儀中對擴增產物進行分析，檢測到熒光信號的被記為陽性反應，沒有檢測到熒光的被記為陰性反應。最后通過QuantaSoft分析軟件計算出質粒的絕對濃度。

1.6統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行。所有拷貝數進行Log10轉換，正態分布資料兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。偏態分布資料采用Mann-WhitneyU檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1ddPCR檢測酶切孵育2 h與4 h后的PUC57質粒結果比較 酶切孵育2 h后檢測結果經Log10轉換后分別為0.146、1.531、2.486、3.475 copies/μL，酶切孵育4 h后檢測結果經Log10轉換后分別為0.663、1.556、2.643、3.623 copies/μL，檢測結果見圖1。兩個酶切孵育2 h與4 h后，ddPCR檢測結果孵育時間后，酶切混合物經過ddPCR檢測所得值與質粒理論值差異均無統計學意義(t=-0.192、-0.403,P>0.05)。

2.2ddPCR檢測酶切與沒有酶切的PUC57質粒 沒有酶切的PUC57質粒檢測結果經Log10轉換后均值分別為0.362、0、0.851、0.398、0.857、2.174 copies/μL，酶切的PUC57質粒檢測結果經Log10轉換后均值分別為0.568、1.656、2.672、3.637、4.681、5.332 copies/μL，檢測結果見圖2。酶切組與沒有酶切組之間差異有統計學意義(Z=-4.194,P<0.05)，酶切組與理論值之間差異無統計學意義(t=-0.2,P>0.05)。

圖1 酶切2 h與4 h的PUC57質粒ddPCR檢測結果

2.3ddPCR檢測放置不同天數的酶切PUC57質粒 選用酶切PUC57質粒的101和103copies/μL的稀釋度，用ddPCR分別檢測剛酶切的、放置在2～8 ℃冷藏2周和4周的PUC57質粒，每個稀釋度各檢測2次，剛酶切的PUC57質粒的101稀釋度的檢測結果均值是47 copies/μL，103稀釋度的檢測結果均值是4 520 copies/μL。2周后的檢測結果分別是30和1 738 copies/μL。4周后的檢測結果分別是20和660 copies/μL。從檢測結果可以看出隨著酶切PUC57質粒放置天數的增加，高低濃度的質粒檢測值在逐漸降低。見圖3。

注：酶切與沒有酶切的PUC57質粒分別用ddH2O稀釋成100、101、102、103、104、105copies/μL，每個稀釋度用ddPCR檢測3次；A為沒有酶切的PUC57質粒組；B為酶切的PUC57質粒組

圖2酶切與沒有酶切的PUC57質粒ddPCR檢測結果

注：A為剛酶切檢測結果；B為酶切后放置2周檢測結果；C為酶切后放置4周檢測結果

圖3放置不同天數的酶切PUC57質粒ddPCR檢測結果

3 討 論

ddPCR由于它是不依賴于外部校準曲線或參考，能敏感的和特異的檢測核酸，同時相比qPCR，它對PCR抑制劑低敏感[8]，已成為一種新的分子檢測技術[9-10]。這項技術是稀有事件檢測或拷貝數變異估計等需要精確定量應用的理想工具[11]。因此，ddPCR的應用越來越廣泛，在癌癥檢測，核酸定量上應用越來越多[12-13]。ddPCR正在迅速取代qPCR作為獨立的DNA定量分析的一種有效方法[14]。本研究對HBV DNA的一段保守區域設計引物和探針，同時對這段保守區域構建質粒，再利用ddPCR檢測含有HBV DNA目的基因的PUC57質粒。

本文在用ddPCR檢測PUC57質粒前先用ECORⅠ酶對構建好的PUC57質粒進行酶切，在酶切過程中用了兩個孵育時間，一個是孵育2 h，另一個是孵育4 h。研究結果顯示，利用ddPCR分別檢測酶切2 h和4 h的PUC57質粒，結果與質粒理論值進行比較，差異無統計學意義(t=-0.192、-0.403,P>0.05)。說明ECORⅠ酶在孵育2 h后就可以把PUC57質粒完全切開，能保證酶切后質粒通過ddPCR的檢測結果和質粒的理論值一致，從而也保證了接下去的ddPCR性能驗證實驗順利進行。所以沒必要擔心酶切時間不足，質粒酶切不完全而影響實驗結果，這與文獻報道的時間相符[15]。

本研究利用ddPCR對酶切和沒有酶切的PUC57質粒進行檢測，對檢測結果進行比較，發現沒有酶切的PUC57質粒ddPCR幾乎沒有檢測出來，而酶切的PUC57質粒檢測結果很好，兩者相比，差異有統計學意義(Z=-4.194,P<0.05)。酶切的PUC57質粒檢測結果與PUC57質粒理論值相比，差異無統計學意義(t=-0.2,P>0.05)。究其原因，可能沒有酶切的PUC57質粒是環狀容易形成超螺旋結構，在高溫變性時雙鏈DNA不容易打開，在低溫退火時引物和探針不能結合到模板鏈上，從而影響了擴增效率。另一方面，可能是ddPCR自身原因導致。伯樂QX200TM微滴式數字PCR是將20 μL的反應體系通過微滴發生器產生20 000個油包水的微滴，每個微滴只有1 nL。沒有酶切的PUC57質粒含有2 806 bp，體積相對比較大，可能不容易形成微滴，從而降低了檢測結果。而酶切過的PUC57質粒只有95 bp的目的基因片段，體積小容易形成微滴，所以檢測結果與PUC57質粒理論值相符。

同時，本研究還對放置了不同時間的酶切PUC57質粒進行檢測。研究結果顯示，放置了2周和4周的酶切PUC57質粒相比剛剛酶切的PUC57質粒，其檢測值在逐漸降低，說明酶切的PUC57質粒隨著放置時間的延長，可能線性DNA模板又還原成環狀的模板，從而降低了擴增效率，該假設有待進一步實驗證明。例如對放置了2周和4周的酶切PUC57質粒進行核酸電泳，看在2 806 bp位置有沒有條帶出現，如果有說明線性DNA模板已還原成環狀的模板，如果沒有就要分析其他原因，如95 bp的線性DNA片段自身發生了降解，具體原因還有待進一步分析。

4 結 論

ddPCR是一種靈敏和準確的新型核酸定量方法，特別是在檢測低拷貝載量。在科研工作中經常會用ddPCR檢測質粒，本研究得出的結論是利用ddPCR檢測含有目的基因的PUC57質粒時要先進行酶切再檢測，酶切時間只需2 h即可將質粒酶切完全，同時酶切的PUC57質粒不宜放置過久，要盡快檢測。