卵泡液中hCG、AMH濃度與IVF-ET結局的關系

牛 犖,田菁燕，李佳琛，李卓成

(1.廣州醫科大學，廣東廣州 510180；2.深圳市羅湖區人民醫院生殖醫學科，廣東深圳 518001；3.深圳市第二人民醫院檢驗科，廣東深圳 518035)

輔助生殖技術(ART)實施過程中，獲得高發育潛能的成熟卵母細胞，進一步培養成優質胚胎是提高ART臨床妊娠率的關鍵，也是近年來生殖醫學領域亟待解決的關鍵問題之一[1-2]。相比于外周血，卵泡液作為卵母細胞的賴以生存的微環境，更能直接影響卵母細胞的生長發育過程、受精能力及發育潛能[3]。因此卵泡液微環境中與卵子發育有關的激素和細胞因子的調控作用越來越受到生殖醫學界的普遍關注[4]。現有研究顯示了外周血人絨毛膜促性腺激素(hCG)、抗苗勒管激素(AMH)與評估卵巢儲備能力及超促排卵過程中的動態變化與妊娠結局間的關系[5-7]，而卵泡液中hCG、AMH 濃度與體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過程中各項指標及妊娠結局間相關性的研究較少。本研究將卵泡液中hCG、AMH 濃度與IVF-ET各參數及助孕結局進行分析，旨在研究卵泡液中hCG、AMH濃度與IVF-ET結局的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年8-11月深圳市羅湖區人民醫院生殖醫學科接受IVF-ET助孕的不孕癥患者162例作為研究對象。年齡25～48歲，平均(35.37±4.96)歲，其中原發性不孕61例，繼發性不孕101例，不孕年限1～10年。162例不孕癥患者根據是否獲卵分為未獲卵組29例和獲卵組133例，其中有103例患者接受了卵裂期新鮮移植，根據103例患者是否獲得臨床妊娠分為妊娠組53例與未妊娠組50例。另外將這103份卵泡液又按照hCG濃度分為hCG<25.0 mIU/mL(A組)、hCG25.0～37.0 mIU/mL(B組)、hCG>37.0 mIU/mL(C組)。納入標準：(1)平素月經周期基本規律，基礎內分泌水平及體質量指數(BMI)正常；(2)6個月內無激素應用史、免疫治療史；(3)B超監測排卵功能正常，子宮及雙側附件無器質性病變。排除標準：(1)多囊卵巢綜合征；(2)子宮內膜異位癥；(3)合并其他影響內分泌水平的內、外科疾病。本研究經醫院倫理委員會審查并討論通過，在充分知情的基礎上獲得患者知情同意書。

1.2方法

1.2.1取卵、受精、胚胎培養、胚胎移植 B超引導下通過連續吸引的負壓裝置吸取卵泡液，并立即在顯微鏡下將卵子移到含胚胎培養液的培養皿中放置于37 ℃的三氣孵箱內培養。取卵后4 h行短時體外受精。接受鮮胚移植的患者培養第3天擇優選擇1～3枚胚胎予以移植，如有胚胎剩余，根據胚胎情況選擇囊胚培養或者玻璃化凍存胚胎。優質胚胎的標準由本中心IVF實驗室制定并寫入標準操作程序：常規IVF/卵胞漿內單精子顯微注射技術 (ICSI)受精,培養至第3天的胚胎細胞數6～10個，均等性良好，碎片含量≤10%。

1.2.2采集卵泡液 B超引導下經陰道逐個穿刺目標卵泡采集卵泡液并立即送至實驗室撿拾卵子，按照如下標準收集卵泡液：(1)卵泡液未被沖卵液及血液污染；(2)卵泡直徑≥15 mm；(3)穿刺所得的卵泡液中的卵冠丘復合體(OCCC)達到Ⅲ級及以上。統一將收集好的卵泡液離心處理，速度為3 000 r/min，離心時間為10 min，去除殘存的纖維蛋白和細胞類物質，取上清液放置于經高壓滅菌的EP管中，-80 ℃凍存待檢，每份樣本僅可解凍1次。

1.2.3檢測方法 檢測卵泡液中的hCG、AMH濃度采用化學發光免疫分析法。整個檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行。hCG檢測限為0.6 mIU/mL，AMH的線性范圍0.10～16.00 ng/mL。

1.4觀察指標 患者年齡、卵泡液中hCG、AMH濃度和獲卵數、卵子成熟度(MⅡ卵率)、兩原核(2PN)率、2PN優質胚胎率，以及臨床妊娠率。

1.5臨床妊娠判斷標準 接受卵裂期新鮮胚胎移植的患者從取卵日開始行黃體支持，胚胎移植后15 d檢測血hCG>100 mIU/mL即為生化妊娠，移植后30 d陰道B超提示宮腔內可見孕囊即判斷為臨床妊娠。

2 結 果

2.1獲卵組與未獲卵組卵泡液中hCG、AMH濃度比較 獲卵組與未獲卵組卵泡液中的hCG、AMH濃度比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2妊娠組與未妊娠組不同指標間比較 根據103例接受卵裂期新鮮胚胎移植的患者是否獲得臨床妊娠分為妊娠組53例，未妊娠組50例。兩組2PN率、2PN優質胚胎率及卵泡液hCG濃度比較差異均有統計學意義(P<0.05)；而兩組年齡、獲卵數、MⅡ卵率及卵泡液AMH濃度比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 獲卵組與未獲卵組卵泡液中hCG、AMH濃度比較±s)

表2 妊娠組與未妊娠組不同指標間比較±s)

2.3各卵泡液hCG濃度組相關指標比較 鑒于妊娠組與未妊娠組卵泡液hCG濃度比較差異有統計學意義(P<0.05)。進一步將接受鮮胚移植的103份卵泡液根據hCG濃度分為3組，兩兩一組進行χ2檢驗對比各項指標顯示，A、B、C組的MⅡ卵率比較差異無統計學意義(P>0.05)。C組2PN率高于A、B兩組，差異有統計學意義(P<0.05)；A組的2PN優質胚胎率低于B、C兩組，差異有統計學意義(P<0.05)；C組的臨床妊娠率優于A組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各卵泡液hCG濃度組相關指標比較[%(n/n)]

注：*P<0.05，與C組比較；#P<0.05，與A組比較

3 討 論

作為卵母細胞賴以生存發育的微環境,卵泡液主要由血漿滲透液及卵巢局部產生的某些物質組成,其內含有許多對卵母細胞發育潛能和受精能力有重要影響的激素和生物活性因子。在ART過程中，如何獲得高質量的成熟卵母細胞并進一步受精發育為高質量的胚胎是取得良好妊娠結局的重要保證。正確掌握注射hCG的時機和劑量是獲取高質量卵子的關鍵。AMH對卵泡的生長發育有著重要意義[8]，研究顯示卵泡內產生的高濃度AMH對正常排卵有著至關重要的作用，而對于排卵前卵泡液AMH濃度與胚胎發育潛能之間的關系仍存在爭議[9-11]。另外，AMH還能對促排卵階段的卵巢反應情況有一定的預測作用，有助于識別有潛在卵巢過度刺激綜合征風險的女性，為臨床醫生判斷和調整促排卵藥物的用量提供依據。值得一提的是，多囊卵巢綜合征因其在促排卵過程中易發生卵巢過度刺激或低反應而成為臨床工作的難點，陳雅等[12]推測，多囊卵巢綜合征患者卵泡液AMH濃度可能與卵泡發育存在相關性。

在促排卵治療過程中，hCG有LH樣作用可以促進卵泡成熟進而誘導排卵。研究顯示體內注射hCG有助于提高卵母細胞胞核成熟的效率[13]，卵母細胞的細胞核和細胞質發育同步化與卵母細胞的受精能力、發育潛能及妊娠結局直接相關[14]。取卵前hCG通常的注射方式是肌肉注射給藥，由于卵巢血供豐富，藥物入血后通過卵巢進入卵泡液，所以說與顆粒細胞和卵母細胞生長發育最息息相關的微環境是卵泡液。研究顯示[15]，當卵泡液hCG濃度在14～21 nmol/L時，有利于提高卵母細胞成熟率、受精率及優質胚胎率，從而提高臨床妊娠率，并推測其機制可能為適宜的hCG濃度促進了卵母細胞質和細胞核的發育同步化，使卵母細胞的受精能力、發育潛能及臨床妊娠率得到提高。

本研究未獲卵組的卵泡液hCG濃度低于獲卵組，差異有統計學意義(P<0.05)，研究結果顯示取卵前按時按量的注射hCG是成功獲卵的重要保證。鑒于妊娠組與未妊娠組的卵泡液hCG濃度比較差異有統計學意義(P<0.05)，進一步將所有接受新鮮胚胎移植的患者分為3個hCG濃度組(A、B、C組)，C組的各項參數及助孕結局相對較好。說明在合適的范圍內，hCG濃度高的各項指標和妊娠結局較好。但是hCG濃度絕不是越高越好，hCG高濃度長時間的使用可能使IVF周期所獲卵母細胞的受精能力和發育潛能降低，增加胚胎著床失敗及早期流產的風險，易導致多胎妊娠的發生率增加，甚至誘發重度卵巢過度刺激綜合征而危及患者生命，由此可見hCG發揮生物學效應具有較嚴格的濃度依賴性。本研究有待于繼續擴大樣本量，深入研究探討hCG濃度的合適范圍，根據卵巢儲備和反應程度制定個性化合理化的hCG使用劑量，降低輔助生育技術并發癥的同時又不影響一定數量高發育潛能的卵母細胞的獲取。

隨著年齡的增加，卵巢儲備功能及卵母細胞質量明顯下降，輔助生育技術的成功率明顯下降，很多卵巢儲備功能不足的高齡患者不得不承受獲卵失敗、無可用胚胎的痛苦。另一方面，在促排卵前評價卵巢儲備功能有助于選擇合理的促排卵方案，個性化調整用藥劑量和時間，提高用藥安全。陳藝等[16]的研究表明，卵泡液AMH一定程度上能夠較好地預測年輕患者IVF-ET的臨床結局。本研究未獲卵組的卵泡液AMH濃度低于獲卵組，差異有統計學意義(P<0.05)。可以推斷出卵泡液中AMH濃度偏低與獲卵失敗之間有直接關系，對于高齡、卵泡數量少、卵巢反應性差及有不良獲卵史的患者，有必要在取卵日留取卵泡液用于檢測AMH濃度來追溯和評估獲卵失敗的原因，為制定后續的治療方案提供依據。

4 結 論

卵泡液中hCG濃度與IVF-ET妊娠結局有相關性,卵泡液AMH濃度與獲卵與否有直接關系，可以用于評估卵巢儲備、追溯獲卵失敗的原因，這些都為卵泡液hCG、AMH濃度與IVF-ET妊娠結局的相關性研究提供了新的思路。但本研究也存在檢測AMH的卵泡液并非來自單個優勢卵泡，無法對該卵泡液中的卵母細胞進行進一步觀察，以及由于條件限制導致樣本量較小等不足之處。總而言之，卵泡液hCG、AMH濃度與IVF-ET妊娠結局的關系尚需擴大樣本量進一步深入研究證實。