葉酸水平、MTHFR基因C677T多態性與宮頸癌的相關性研究

薛雄燕,朱嫦琳,潘練華,黃少珍,黃燕婷,馬婉珍,李煒煊

(佛山市第一人民醫院檢驗科,廣東佛山 528000)

宮頸癌是婦女常見的惡性腫瘤之一，發病率高，嚴重影響廣大婦女的身心健康。宮頸癌的發生是多階段、多步驟，有多重因素參與，其中已有研究指出葉酸缺乏與宮頸癌的發生發展密切相關[1-3]，但目前得到的結論并不一致。葉酸生物學作用的發揮受到體內一些酶的影響，其中，5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝過程中的關鍵酶，在葉酸參與DNA甲基化反應的過程中起重要作用。MTHFR基因具有單核苷酸多態性，多態性位點的突變可引起其編碼的酶活性下降，推測可能與葉酸水平變化相關。因此，本研究通過檢測宮頸癌患者及正常對照者血清葉酸水平及分析MTHFR基因C677T多態性，明確其與宮頸癌易感性的關系，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 病例組選自2015年3月至2018年2月佛山市第一人民醫院婦科及腫瘤內科住院的確診為宮頸癌患者82例作為病例組，均為女性，年齡36～51歲，平均(44.39±3.74)歲。病例組宮頸癌分期為二期38例，三期44例。組織學分型為腺癌6例，鱗癌76例。對照組選取同期與病例無血緣關系的體檢者共82例，均為女性，年齡35～52歲，平均(45.12±3.89)歲。所有研究對象均為人類乳頭瘤病毒(HPV)-16陽性，兩組年齡和性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究方案經醫院倫理委員會審核通過，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2納入標準及排除標準 病例組患者均經病理確診為宮頸癌。所有納入研究的人群均排除合并嚴重心、肝、腎、肺疾病者、妊娠期及哺乳期婦女、合并其他惡性腫瘤者，所有研究對象無血緣關系。

1.3MTHFR基因C677T多態性檢測原理 采用聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態性分析(PCR-RFLP)方法，擴增產物由識別多態性位點的特異性核酸內切酶進行酶切，酶切片段經電泳分析，根據電泳條帶區分基因型。

1.4儀器與試劑 采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管采集研究對象外周靜脈血2 mL，用于MTHFR基因C677T多態性檢測，采用黃色促凝膠真空采血管采集周靜脈血3 mL，3 500 r/min離心10 min后，上層血清用于葉酸檢測。亞甲基四氫葉酸還原酶基因677C/T 檢測試劑盒(PCR-RFLP)購自深圳市奧薩制藥有限公司，檢測儀器為ABI公司7500熒光實時定量PCR儀。葉酸檢測采用Roche公司E601全自動電化學發光分析儀及配套試劑。所有操作嚴格按照說明書。

1.5檢測方法

1.5.1DNA提取 在1.5 mL離心管中加入300 μL充分搖勻的變性液及55 μL抗凝全血，室溫放置5 min后，12 000 r/min離心3 s，棄去上清，在管底紅褐色沉淀中加分次加入洗滌液A、洗滌液B和無水乙醇洗滌后離心棄去上清，沉淀置于65 ℃金屬浴中干燥約20 min后，加入55 μL溶解液混勻，12 000 r/min離心3 s，吸取上清備用。

1.5.2PCR擴增反應 在PCR反應管中加入試劑盒中的PCR擴增混合液21.8 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL及待檢DNA樣品3 μL，置于PCR擴增儀按以下擴增程序進行：94 ℃變性30 s、65 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s，共35個循環。

1.5.3酶切反應 每管加入酶切緩沖液4.7 μL、限制性內切酶0.3 μL和10 μLPCR產物，37 ℃溫育1 h。

1.5.4電泳檢測及結果分析 采用1×TBE配制2%瓊脂糖凝膠，酶切反應管中加入電泳上樣緩沖液5 μL，取10 μL加入瓊脂糖凝膠加樣孔中，5 v/cm電壓下電泳45 min，根據電泳帶型模式圖判斷基因型。

1.6統計學處理 采用統計學軟件SPSS19.0進行數據處理。等位基因頻率用基因頻率計數法進行計算，Hardy-Weinberg(H-w)平衡采用擬合優度χ2檢驗，組間的基因型及基因頻率比較采用χ2檢驗，應用OR值及其95%的可信區間(CI)來估計其相對危險度；P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1血清葉酸水平與宮頸癌的關系 病例組血清葉酸水平(8.63±5.63) μg/L低于對照組(10.84±5.99)μg/L，差異具有統計學意義(t=2.43，P=0.016)。

2.2不同組別MTHFR基因C677T基因型分布情況 對病例組和對照組的MTHFR基因C677T位點各基因分布進行Hardy-weinberg平衡檢驗，分布符合遺傳平衡法則(P>0.05)，說明樣本具有代表性，各種基因型電泳圖見圖1。表1顯示了MTHFR基因C677T各基因型的分布情況。其中，病例組和對照組均為雜合型(CT)頻率最高，病例組純合型(TT)高于野生型(CC)，而對照組則相反。兩組間各基因型頻率不一致，差異具有統計學意義(χ2=7.529，P=0.023)。兩組人群MTHFR基因C677T等位基因頻率比較結果顯示，病例組T等位基因頻率高于C等位基因，與對照組的基因分布不一致，差異具有統計學意義(χ2=5.903，P=0.015)。

注：1純合型(TT)；2雜合型(CT)； 3野生型(CC)； 4雜合型(CT)； 5雜合型(CT)； 6陽性質控

圖1 各種基因型電泳圖

2.3MTHFR基因C677T多態性與宮頸癌易感性分析 與野生型(CC)人群相比，純合型(TT)人群患宮頸癌的危險性顯著增高(OR=3.485，95%CI：1.331～9.122)，而雜合型(CT)人群對宮頸癌患病的危險性未發現顯著影響(OR=1.752，95%CI：0.810～3.789)。見表2。

表2 MTHFR基因C677T多態性與宮頸癌易感性的關系

2.4血清葉酸和MTHFR基因多態性相互作用與宮頸癌易感性分析 結合考慮人群血清葉酸水平和MTHFR基因C677T多態性相互作用，與宮頸癌易感性的相關性進行分析，結果顯示，在葉酸充足人群中，MTHFR基因型為純合型(TT)的人群患宮頸癌的危險為2.057倍(95%CI：0.455～9.304)，而葉酸不充足且MTHFR基因型為純合型(TT)的人群患宮頸癌的危險則上升為4.354倍(95%CI：1.195～15.865)。見表3。

表3 血清葉酸和MTHFR基因多態性相互作用與宮頸癌易感性的關系

3 討 論

宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二大女性致死癌癥，每年全世界約有50萬新發病例，死亡人數超過27萬。國家癌癥中心發布的研究數據表明，我國在2014年宮頸癌患病率居全世界第二。宮頸癌的病因尚未完全明確，葉酸屬于B族維生素，可參與DNA的合成和甲基化。葉酸缺乏則導致DNA甲基化異常和DNA修復障礙，從而增加腫瘤發生的風險。最近有研究指出，葉酸缺乏可能與宮頸癌發生密切相關，但尚未得出一致的結論。本研究分別檢測宮頸癌患者及對照者血清葉酸水平，發現宮頸癌患者血清葉酸水平顯著低于對照組，與之前報道一致[4-5]，提示葉酸缺乏可能增加宮頸癌發生的危險。

MTHFR是葉酸代謝過程中的關鍵酶，能不可逆催化N5,N10-亞甲基四氫葉酸轉化為N5-甲基四氫葉酸，為甲基循環提供供體，維持機體DNA正常甲基化反應，參與DNA合成。MTHFR基因具有單核苷酸多態性，常見的多態性位點為C677T，其野生型(CC)可發生一個位點突變，為雜合型(CT)，或兩個位點突變，為純合型(TT)。C677T位點的突變可導致MTHFR發生酶活性改變，其中雜合型(CT)酶活性只有野生型(CC)的65%，而純合型(TT)的酶活性則只有30%左右。MTHFR酶活性的降低，可導致血清葉酸水平下降，引起DNA甲基化異常和DNA合成障礙，可能參與腫瘤的發生發展過程。國內外已有研究指出C677T多態性與乳腺癌、大腸癌、白血病等發生密切相關[6-8]。本研究對宮頸癌患者及對照組MTHFR基因C677T多態性進行檢測，結果顯示，研究所選的樣本等位基因分布符合H-w平衡，具有群體代表性，在宮頸癌患者中，純合型(TT)所占比例為30.5%，顯著高于對照組(13.4%)，對等位基因頻率比較的結果也顯示，病例組T等位基因頻率高于C等位基因，與對照組相反，提示MTHFR基因的純合型(TT)是宮頸癌的易感基因，其患宮頸癌的風險較野生型(CC)人群顯著增加(OR=3.485，95%CI：1.331～9.122)，與之前的研究報道基本一致[9-11]。

有研究認為，MTHFR基因C677T多態性與腫瘤發生風險的關系，受血清葉酸水平的影響，存在一定的交互關系。MTHFR是葉酸代謝過程的關鍵酶，MTHFR基因發生突變可導致酶活性下降，從而改變個體對腫瘤的遺傳易感性，同時也引起體內葉酸水平的改變。然而，葉酸水平可以通過膳食進行補充，在一定程度上降低由于MTHFR基因突變人群的腫瘤易感風險。因此在考慮MTHFR基因多態性對腫瘤的影響時，必須同時考慮體內實際葉酸水平，才能正確評估個體的遺傳易感性。對MTHFR基因C677T多態性與結直腸癌發生風險的研究結果指出，純合型(TT)的個體發生結腸癌的風險低于雜合型(CT)和野生型(CC)個體，然而，當葉酸水平不足時，純合型(TT)的保護作用減弱，甚至可能轉變為結腸癌發生風險增加[7]。同樣的，對MTHFR基因C677T多態性與乳腺癌發生風險的研究也認為，純合型(TT)攜帶者與乳腺癌發生風險呈正相關的現象僅存在于葉酸不足的婦女當中[6]。因此，本研究對血清葉酸和MTHFR基因多態性相互作用與宮頸癌易感性進行了綜合分析。結果顯示，在葉酸充足人群中，MTHFR基因型為純合型(TT)的人群患宮頸癌的危險性較對照組并無顯著增加，而在葉酸不充足且MTHFR基因型為純合型(TT)的人群中，患宮頸癌的危險則顯著上升為野生型(CC)的4.354倍(95%CI：1.195～15.865)，提示在存在MTHFR基因突變的個體中，補充充足的葉酸也有利于降低宮頸癌的發生風險，與BADIGA等[12]研究結論基本一致。

4 結 論

研究結果表明，MTHFR基因C677T多態性是宮頸癌發生的易感因素，該基因的純合型(TT)可增加宮頸癌發生的危險，在低葉酸水平的純合型(TT)人群中，發生宮頸癌風險最高。由于本研究所納入的研究對象均已證實為HPV-16陽性，可排除HPV-16感染對統計結果的影響。然而，由于條件所限，本研究的樣本量較小，在后期試驗中應加大樣本量，并納入HPV-16陰性人群進行分析研究，進一步明確葉酸、MTHFR基因多態性及HPV-16與宮頸癌的相互關系。