丙型肝炎病毒抗體酶聯免疫吸附試驗試劑盒穩定性評價探討

閆渝松，唐 娟，周雪蓮

(重慶市大足區人民醫院，重慶 402360)

丙型肝炎病毒抗體(抗-HCV)檢測是我國法定血液篩查項目之一，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測方法是目前檢測抗-HCV的主要檢測方法，目前絕大多數血站還是采用“兩遍酶免+一遍核酸”的檢測策略[1]。《血站技術操作規程》(2015版)正式提出了病毒核酸檢測試劑通過批簽發之后可采用“一遍酶聯免疫+一遍核酸”的檢測策略[2]。由于不同的檢測試劑和系統之間存在差異[3-4]，在改變血液檢測策略、減去一遍酶聯免疫檢測實驗時，如何對現用的檢測試劑進行取舍需要非常慎重地決策。選擇試劑時需要對試劑性能進行全面考察。試劑使用期間的穩定性是試劑的重要性能之一，需要進行有效地評估才能選擇適合本實驗室使用的試劑。為此，本實驗室以抗-HCV試劑盒(ELISA法)為例，對該試劑在2017年4月至2018年3月使用期間的穩定性評價進行探索，評價試劑盒使用期內批內穩定性、日間穩定性和批間穩定性三方面性能，為選擇試劑血液篩查試劑提供參考。

1 材料與方法

1.1標準血清 濃度為0.5 NCU/mL的抗-HCV標準血清(北京康徹思坦，批號：201710021)。

1.2儀器與試劑 RT-6100酶標儀(深圳杜雷公司)；抗-HCV ELISA檢測試劑盒(廈門英科新創科技有限公司，批號：2017035809,2017075817，2017125830)。

1.3方法

1.3.1檢測方法 抗-HCV檢測試劑盒和標準血清從試劑儲存冰箱取出后在18～25 ℃室溫條件下平衡40 min。按照試劑說明書參數要求和步驟檢測標準血清。檢測完成后，根據試劑說明書的Cut off值計算公式計算每次實驗的Cut off值和標準血清的S/Co值。

1.3.2質控保障措施 嚴格控制標準血清和試劑盒在室溫平衡溫度和時間。標準血清復融后充分混勻，每次檢測混勻次數控制在30次左右，排除質控品凍融過程對檢測結果的影響。選擇S/Co值在2～5的標準血清作為質控品，能夠更靈敏地反映試劑的性能。

1.3.3試劑盒批內穩定性評價 每一批試劑投入使用前，在同一次試驗中、同一塊酶標板內、對一次混勻的標準血清進行重復檢測，每一批試劑檢測40孔(n=40)。分析每孔檢測結果的S/Co值之間的差異，以此來評價抗-HCV試劑盒的批內穩定性。

1.3.4試劑盒日間穩定性評價 記錄每一批試劑使用期內每一天檢測的室內結果，采用變異系數(CV)來分析檢測結果日間差異性，評價抗-HCV試劑盒使用期的日間穩定性。

1.3.5批間穩定性評價 收集分析的3批次試劑使用期內室內質控的檢測結果，分析3批次試劑之間的差異性，評價抗-HCV試劑盒使用期內的批間穩定性。

2 結 果

表1 3批次試劑批內穩定性評價結果

圖1 抗-HCV試劑盒批內穩定性箱線圖分析結果

表2 3批次抗-HCV試劑盒日間穩定性評價結果

圖2 抗-HCV試劑盒日間穩定性箱線圖分析結果

3 討 論

2015年底我國實現了獻血者血液病毒核酸檢測全覆蓋[6]，在國家對核酸檢測試劑實行批簽發之前，本單位仍采用“兩遍酶免+一遍核酸”的血液檢測策略。2017年4月至2018年3月本單位使用了3批次ELISA抗-HCV試劑進行了231次檢測,篩查獻血者血液是否符合國家要求。檢測試劑使用期間的穩定性是試劑性能評價的主要內容之一，對血液篩查結果非常重要，性能穩定的血液篩查試劑是開展獻血者感染性指標檢測的重要基礎[7]。本實驗室對3批試劑的231次室內質控結果進行了統計分析來評估試劑的穩定性。

在試劑使用期間穩定性評價過程中，本實驗室選用抗-HCV水平為0.5 NCU/mL標準血清作為質控品。在本實驗室檢測條件下，采用英科新創ELISA抗-HCV試劑盒檢測標準血清的S/Co值大部分結果在3～5。這個檢測結果范圍能夠靈敏地反應試劑盒的穩定性[2]。本研究實驗過程中使用同一廠家、同一批號的標準血清作為試劑穩定性評價材料。每一次檢測前的準備過程中，凍存標準血清的復融條件和混勻操作進行了嚴格的控制。復融溫度、復融時間、混勻方式和顛倒混勻次數都進行了統一的規定，工作人員之間操作定期進行人員比對。這些質量控制項目可以減少材料不均一和工作人員之間操作的差異對評價結果的影響，以客觀、有效地評價試劑盒穩定性。

在評價結果分析環節，本研究采用了兩種評價方法對ELISA抗-HCV試劑的穩定性進行了評價。一方面，本實驗室采用了CV值判斷試劑使用期間的批內、日間和批間差異性。使用CV值判斷試劑穩定性可以對試劑的總體穩定性作出評價[8]。另一方面，本研究還進一步使用了箱線圖來回顧性地分析質控結果，用于判斷每一批次質控結果中出現極值的情況。當質控標準血清檢測結果的S/Co值大于3倍四分位數間距時判定為極值。采用箱線圖分析質控血清檢測結果能夠更加敏感地反應試劑在使用過程中出現的某一次檢測結果的異常現象[9]。綜合上述兩個評價指標來反映抗-HCV試劑盒在使用過程中的穩定性更加科學和有效。

ELISA試劑的批內穩定性代表該批次試劑酶標板的每一孔之間的差異[10]。本實驗室3個批次的試劑采用同一次混勻的標準血清重復檢測40孔，3批次試劑結果S/Co值的變異系數分別為8.6%、7.4%和8.1%，3批次試劑在對標準血清的檢測中均未出現極值，說明被評價的試劑盒孔間差異較小，具有較好的批內穩定性。試劑盒的日間精密度是代表試劑使用期間日間的穩定性的指標[11]，可以反映試劑盒在常規儲存環境條件及檢測條件下維持檢測性能的能力。本實驗室統計分析了3批次試劑盒在使用期間連續檢測同一批號標準血清的結果，3批試劑CV值均小于15%，符合常規質控的標準。在箱線圖分析結果中，箱線圖分析結果中，2017035809批次試劑在第42天出現1個高于上四分位間距的極值，出現極值的概率為1.2%；2017075817在第15天、第16天和第35天出現3個高于上四分位間距的極值，概率為3.1%；2017125830批次試劑使用期間未出現極值。分析結果說明該試劑盒在本實驗室的儲存環境條件和實驗條件下能夠維持較為穩定的檢測能力，具有較好的日間穩定性。ELISA試劑的批間穩定性反映每一批試劑之間的差異。該性能受試劑盒生產原材料、制備工藝、后期運輸和儲存條件等因素的影響[12]。本研究統計3批次試劑在使用期間檢測標準血清的結果，總體CV=10.5%，符合ELISA試劑批間差異小于20%的質控標準，說明該試劑盒批間穩定性較好。

在改變血液篩查策略時，應盡量選擇穩定性好的試劑用于血液篩查[13]。本研究對結合批內檢測數據和室內質控數據進行分析，對ELISA抗-HCV試劑盒在使用期間的批內穩定性、日間穩定性和批間穩定性等三方面穩定性能進行全面評價，可為在選擇抗-HCV篩查試劑提供部分參考依據。