育麟方改善老齡雌性小鼠超促排卵作用的機制研究

馬景張馳章勤何嘉琳劉曉昱繆晨韻

1.杭州市中醫院 杭州 310007 2.浙江中醫藥大學 3.溫州市中醫院

近三十年，隨著生殖醫學臨床研究和生殖生物學基礎研究的不斷創新和進步[1]，以體外受精-胚胎移植為代表的輔助生育技術已成為不孕癥患者的常規治療方式，并已取得明確療效。通過輔助生殖技術誕生的嬰兒數量急劇上升，大約占據發達國家新生兒數量的2%～5%[2]。體外受精-胚胎移植成功的重要前提是獲得適量且高質量的卵母細胞，但38周歲以上的高齡女性容易出現卵巢儲備功能下降（diminished ovarian reserve，DOR），卵巢內可利用的卵母細胞數量和質量均下降，控制性超促排卵常表現為卵巢反應低下、獲卵少且質量不佳，從而導致妊娠率和活產率降低[3]。雖然有研究認為補充脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone,DHEA）可以延緩卵巢衰老，改善卵子質量[4]，但這一結果仍存有爭議[5]。因此，尋求安全、有效的藥物改善高齡女性卵巢儲備功能，是提高體外受精-胚胎移植成功率的關鍵所在[6]。

育麟方是浙江何氏婦科調經助孕的經驗方，以“補腎益精養血”立法，治療不孕癥療效顯著。臨床研究表明該方具有改善卵巢儲備功能的作用[7]，但具體機制仍尚未明確。本研究在前期實驗[8-9]的基礎上，以6～7月齡的C57BL/6J老齡雌性小鼠為對象，探究育麟方對老齡女性超促排卵的影響及相關作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6J健康雌性小鼠70只，6～7 月齡，體質量（29.27±0.91）g；SPF 級 C57BL/6J健康性成熟小鼠28只，6～8周齡，雌、雄各14只，體質量（18.09±0.17）g，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供 [實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2012-0001]。所有小鼠均飼養于浙江中醫藥大學動物中心SPF級動物房 [實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184]，均分籠飼養，每籠4～5只。自動控制12h/12h光/暗循環，相對濕度40%～50%，室溫20～25℃。普通飼料喂養，自由攝食，充分給水，適應性飼養1周后用于實驗。

1.2 實驗藥物與試劑 育麟方組成為菟絲子30g、枸杞子 12g、當歸 10g、川芎 10g、熟地 10g、巴戟天 10g、肉蓯蓉10g、仙靈脾15g、蛇床子6g、覆盆子15g、黨參15g、炙甘草3g，以上藥物均購自杭州市中醫院。DHEA購自美國GNC公司（批號：54972B16）；注射用人絨毛膜促性腺激素（human choionic gonadotophin，HCG）、注射用孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）均購自寧波市三生藥業有限公司（批號：B160702、S160907）；改良人類輸卵管液（modified human tubal fluid medium，mHTF）、人類輸卵管液（human tubal fluid medium，HTF）、Serum Substitute Supplement（SSS；3S）均購于 Irvine Scientific 公司 （批號：90126170602、90125180920、99193）；透明質酸酶購自 Sigma公司（批號：H4272）；抗β-catenin抗體、抗Wnt4抗體均購于Abcam公司（批號：ab32572、ab91226）；GAPDH(14C10)Rabbit mAb購于Cell Signaling Technology公司（批號：2118S）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 小鼠適應性飼養1周后采用“陰道脫落細胞涂片法”觀察動情周期15d，參考繆晨韻等[10]的方法，采用隨機數字表法將6～7月齡C57BL/6J雌性小鼠分為育麟方高劑量組、育麟方中劑量組、育麟方低劑量組、DHEA組、老齡對照組，另選擇6～8周齡C57BL/6J雌性小鼠為青年對照組。每組小鼠14只，其中7只用于卵母細胞實驗，余下7只用于體外受精實驗。6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠單獨飼養，用于體外受精實驗。

1.3.2 實驗藥物制備 育麟方濃縮液：取育麟方8劑（藥材總重1 168g）加蒸餾水7 000mL，煎煮1h后過濾，藥渣再加水7 000mL煎煮1h后過濾，合并兩次濾液，加熱揮發去多余水分，濃縮至700mL，冷卻12h后分裝至12支離心管，4 000r/min離心7min。取上層藥液定容為 630mL，藥物濃度為 1.85g·mL-1，4℃儲存備用。1 000U PMSG溶于0.9%氯化鈉溶液10mL中，配成濃度為100U·mL-1的PMSG溶液。1 000U HCG溶于0.9%氯化鈉溶液10mL中，配成濃度為100U·mL-1的HCG溶液。mTHF與SSS以9:1的比例混合配成HEPES緩沖液。

1.3.3 給藥與實驗方法 根據魏偉等[11]所著《藥理實驗方法學》中“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”，計算育麟方的小鼠臨床等效劑量。DHEA組根據成人口服劑量，予10.2mg/kg·d灌胃[12]；育麟方高、中、低劑量組分別予成臨床成人用藥劑量的2、1、0.5倍，即生藥 25.0g/kg·d、12.0g/kg·d、6.0g/kg·d 灌胃；青年對照組、老齡對照組均用蒸餾水0.2mL/10g·d灌胃，各組均連續灌胃40d。

所有小鼠灌胃第38天17:00腹腔注射10U PMSG，48h后腹腔注射10U HCG，16h后處死小鼠進行后續實驗。

1.3.4 小鼠卵母細胞收集及計數 小鼠頸椎脫臼處死后，置于覆蓋有干燥吸水紙的恒溫板上。打開腹腔，充分暴露子宮、輸卵管和卵巢后，分離雙側輸卵管壺腹部，置于含HEPES緩沖液的無菌培養皿中備用。在體式顯微鏡下，以1mL注射器的針頭輕輕劃開輸卵管壺腹部隆起處，暴露卵丘團。以200μL移液槍將卵丘團置入含有0.2%透明質酸酶的HEPES緩沖液中進行消化，5～10min后顯微鏡下計數消化好的卵母細胞數量。

1.3.5 小鼠體外受精與胚胎培養

1.3.5.1 備盤 實驗前1d預先解凍HTF。準備好受精盤、培養盤，并放入恒溫箱平衡。

1.3.5.2 雄鼠精子分離及活性觀測 7只C57BL/6J雄性小鼠頸椎脫臼處死后開腹摘除附睪，清理干凈后放入含有HTF的EP管，在培養箱中放置10min。用移液槍吸取EP管上1/3的液體，滴在培養皿蓋子上，在倒置顯微鏡下觀察精子密度和活力。取密度適中、活力佳的精子用于體外受精實驗。

1.3.5.3 卵丘卵母細胞復合體（cumulus oocyte complex，COCs）獲得 雌性小鼠處死后，開腹剝離卵巢與輸卵管，剪下輸卵管壺腹后用1mL注射器針頭輕輕劃開輸卵管壺腹部隆起處，暴露白色絮狀COCs。以200μL移液槍將COCs轉移至受精盤中。

1.3.5.4 體外受精 取密度適中、活力佳的精子10μL，加入含有COCs的HTF受精滴中，置于37℃、5%CO2的胚胎培養箱中培養。6h后在體式顯微鏡下用口吸管撿卵，每個受精卵洗滌3遍后觀察2原核。

1.3.6 小鼠卵巢的處理 將小鼠頸椎脫臼處死后打開腹腔，充分暴露子宮、輸卵管和卵巢，摘取雙側卵巢，稱重后放入干凈滅菌的EP管中，-80℃保存，用于Western blot檢測。

1.3.7 小鼠卵巢指數、成熟卵率、受精率計算 卵巢指數（%）=小鼠卵巢質量/體質量×100%。成熟卵率（%）=成熟卵數/卵母細胞數×100%；受精率（%）=受精卵數/成熟卵數×100%。

1.3.8 Western blot檢測卵巢組織中Wnt4、β-catenin的蛋白表達 提取小鼠卵巢組織總蛋白，BCA法測蛋白濃度，變性后取30μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉膜，封閉 1h后加入一抗（1:1 000），4℃過夜。TBST洗膜3次后，加入二抗（1:5 000）室溫孵育1h，TBST洗膜3次，ECL化學發光法曝光。以GAPDH（1:1 000）為內參，通過Image J軟件分析光密度，計算目標蛋白與內參蛋白的灰度比值，進行半定量分析。

1.4 統計學分析 應用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，服從正態分布的計量資料以±s表示，滿足方差齊性者，多組間采用One-way ANOVA檢驗；不服從正態分布采用 Kruskal-Wallis檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠卵巢指數比較 與青年對照組比較，其余各組卵巢指數明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與老齡對照組比較，育麟方高、中劑量組、DHEA組卵巢指數明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與育麟方高劑量組比較，育麟方中、低劑量組、DHEA組明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表 1。

表1 各組小鼠卵巢指數比較（±s）Tab.1 Comparison of ovarian indexes of mice in each group(±s)

表1 各組小鼠卵巢指數比較（±s）Tab.1 Comparison of ovarian indexes of mice in each group(±s)

注：與青年對照組比較，**P＜0.01；與老齡對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與育麟方高劑量組比較，##P＜0.01Note:Compared with young control group,**P＜0.01;compared with aged control group,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;compared with Yulin formula high dose group,##P＜0.01

7.80±0.56 2.97±0.42**3.68±0.21**▲▲##3.40±0.16**##3.48±0.51**▲##4.78±0.44**▲▲組別 n 小鼠體重（g） 卵巢重量（mg） 卵巢指數（%）青年對照組老齡對照組DHEA組育麟方低劑量組育麟方中劑量組育麟方高劑量組7 7 7 7 7 7 20.16±0.48 30.13±0.64 29.90±1.08 29.66±0.98 30.09±0.97 30.23±1.01 15.70±0.81 8.93±1.09 10.99±0.60 10.07±0.55 10.47±1.49 14.44±1.32

2.2 各組小鼠卵母細胞數量比較 與青年對照組比較，其余各組卵母細胞數量顯著減少，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與老齡對照組比較，育麟方高、中、低劑量組、DHEA組卵母細胞數量顯著增多，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與育麟方高劑量組比較，育麟方中、低劑量組、DHEA組卵母細胞數量均顯著減少，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

2.3 各組小鼠成熟卵率與受精率比較 與青年對照組比較，其余各組小鼠成熟卵率顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與老齡對照組比較，育麟方高劑量組小鼠成熟卵率增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與育麟方高劑量組比較，育麟方低劑量組成熟卵率降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與青年對照組比較，其余各組受精率均顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）；其余各組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 3。

表2 各組小鼠卵母細胞數量比較（±s，個）Tab.2 Comparison of oocyte number of mice in each group(±s，number)

表2 各組小鼠卵母細胞數量比較（±s，個）Tab.2 Comparison of oocyte number of mice in each group(±s，number)

注：與青年對照組比較，**P＜0.01；與老齡對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與育麟方高劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note:Compared with young control group,**P＜0.01;compared with aged control group,▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;compared with Yulin formula high dose group,#P＜0.05,##P＜0.01

組別n 卵母細胞數29.14±1.46 3.00±1.15**8.29±2.21**▲▲#5.14±1.21**▲##7.43±1.72**▲▲##10.43±2.23**▲▲青年對照組老齡對照組DHEA組育麟方低劑量組育麟方中劑量組育麟方高劑量組7 7 7 7 7 7

2.4 各組小鼠卵巢β-catenin蛋白表達比較 與青年對照組比較，老齡對照組、育麟方中、低劑量組、DHEA組β-catenin表達明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01），育麟方高劑量組β-catenin表達則無統計學差異（P＞0.05）；與老齡對照組比較，育麟方高劑量組表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與育麟方高劑量組比較，育麟方中、低劑量組、DHEA組β-catenin表達均下降，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見圖 1。

表3 各組小鼠成熟卵率與受精率比較Tab.3 Comparison of mature egg rate and fertilization rate of mice in each group

2.5 各組小鼠卵巢Wnt4蛋白表達比較 老齡對照組小鼠卵巢Wnt4蛋白表達略低于青年對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05），各組間比較，Wnt4蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

3 討論

女性的年齡、移植胚胎階段和數量是影響體外受精活產率的主要因素[13]。隨著年齡的增長，女性卵巢儲備功能逐漸下降，表現為月經周期紊亂伴隨生育能力下降。即使采用體外受精治療，也常表現為卵巢低反應[14]，同時周期取消率高、臨床妊娠率低、活產率更低。Devesa等[3]研究表明，38歲以后女性體外受精累積活產率顯著下降，38～39歲為 25.9%、40～41歲為16.4%、42～43歲為 7%、44歲及以上為 1.2%[3]。DOR主要表現為卵子數量和質量的雙重下降，因此，如何改善老齡女性的DOR，提高卵母細胞數量和質量是目前生殖醫學領域研究熱點。

圖1 各組小鼠卵巢β-catenin蛋白表達比較Fig.1 Comparison of expression of β-catenin protein in ovaries of mice in each group

圖2 各組小鼠卵巢Wnt4蛋白表達比較Fig.2 Comparison of expression of Wnt4 protein in ovaries of mice in each group

本研究采用的C57BL/6J小鼠是1975年我國從日本國立腫瘤研究所引進的近交系動物，青年C57BL/6J雌性小鼠單次產仔數為 6～7只，12月齡就不再產仔，其生育能力較其他品系小鼠低下[15]，因此常被用于DOR、卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）等生殖功能相關研究。前期實驗發現6～7月齡C57BL/6J雌性小鼠不但表現為動情周期延長、動情頻率下降，而且血清抗苗勒管激素水平下降，卵巢石蠟染色切片表現為卵巢萎縮，髓質組織多，卵泡數目少，顆粒細胞層數減少，排列稀疏且閉鎖卵泡較多[10]。本實驗中，老齡對照組小鼠卵巢指數顯著低于青年對照組，每只小鼠獲得卵母細胞數量也顯著少于青年對照組。根據卵周隙與第一極體形態建立的評價體系是目前公認的卵母細胞質量評價指標[16]。根據該方法，本研究中形態學觀察提示，老齡對照組卵母細胞中未成熟卵、碎卵明顯增多，成熟卵率顯著低于青年對照組小鼠，直接導致受精率顯著降低。

DOR表現為月經周期紊亂、生育能力下降，其臨床表現隸屬于中醫“月經失調”“不孕癥”等范疇。腎為先天之本，主生殖，是女性“腎-天癸-沖任-胞宮生殖軸”的基礎，因此，補腎填精是治療DOR的主要治則。育麟方是何氏婦科經驗方，由武之望[17]所著的《濟陰綱目》中蓯蓉菟絲丸加減化裁而成，方以菟絲子、仙靈脾為君，補腎填精、溫補腎陽；枸杞子、覆盆子、肉蓯蓉、巴戟天為臣，補肝腎、益精血；當歸、川芎、熟地、蛇床子為佐藥，取其“四物湯”之意，補血調血。全方以補腎填精、健脾養血為主，臨床研究表明具有改善卵巢功能的作用[7]。動物實驗證實，高劑量育麟方可以顯著改善老齡小鼠動情周期，提高血清抗苗勒管激素水平，增加卵巢內初級卵泡及總卵泡數[10]。DHEA由腎上腺皮質和卵巢合成，是多種激素的前體物質，具有多向性的激素緩沖作用，能雙向調節女性生殖內分泌水平，改善卵巢微環境。研究表明，在體外受精前以DHEA預處理，可以提高DOR患者卵泡微環境中抗苗勒管激素等物質水平，從而提高優質胚胎率，改善妊娠率[18-19]。本實驗發現，高劑量育麟方可提高老齡小鼠卵巢指數，增加卵母細胞數量和成熟卵率，療效優于DHEA。由于老齡小鼠在促排卵后所獲卵母細胞數量極少，雖然育麟方治療后老齡對照組小鼠受精率有上升的趨勢，但各治療組間無統計學差異。若能進一步擴大實驗小鼠數量，或者統一各組間成熟卵數后進行體外受精率比較結果可能更理想。

β-連環蛋白（β-catenin）作為 Wnt/β-catenin信號通路的核心成分，具有參與黏附連接形成，促進細胞遷移和細胞間交流，促進細胞增殖、分化、凋亡等作用。在小鼠始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡、小竇狀卵泡、閉鎖卵泡中都有不同程度的表達[20]。Prunskaitehyyryl inen等[21]研究認為，β-catenin通過促進顆粒細胞增殖等方式參與卵泡的生長發育。本研究發現，βcatenin在老齡小鼠卵巢中表達顯著降低，而育麟方可以提高β-catenin的蛋白表達，且呈濃度相關性，表明育麟方可能通過調節β-catenin表達影響卵泡生長發育。有研究表明Wnt信號通路與女性生殖功能密切相關[22]，影響性腺細胞增殖和分化[23]；Wnt4在卵巢顆粒細胞中顯著表達，參與苗勒管發育和卵巢激素生物合成的調節[24]。盡管有證據表明Wnt信號通路通過β-catenin在人類的卵泡形成和發育過程中起作用，但原始卵泡與優勢卵泡中Wnt4蛋白表達并無明顯差異[25]，敲除Wnt4基因也并不影響成年小鼠卵巢中原始、初級、次級、小竇狀卵泡的數量以及排卵率[26]。本研究也顯示各組小鼠卵巢組織Wnt4蛋白表達無統計學差異，與上述研究結果一致。因此，本研究雖然證實育麟方通過影響β-catenin表達參與卵泡生長發育的調控，但其上游影響位點有待進一步研究。

中醫藥在輔助生殖中的應用已取得較好的臨床療效，但具體作用機制仍未闡釋清楚。本實驗提示育麟方通過影響卵巢內β-catenin表達,參與調控卵泡生長發育，從而改善卵巢生殖功能，對于老齡小鼠可以提高促排卵獲卵數量和質量，進而提高體外受精率，但具體作用途徑有待進一步研究。