葛根素激活SIRT3/SOD2信號通路緩解多柔比星心臟毒性實驗研究*

馬 超，郭萬剛，馬文帥

空軍軍醫大學唐都醫院心血管內科(西安 710038)

多柔比星(Doxorubicin，DOX)是蒽環類抗腫瘤藥物的成員之一，具有強效抗腫瘤作用。它廣泛用于治療乳腺癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤和其他類型的癌癥[1-2]。多柔比星最主要的副作用是心臟毒性，多柔比星累積劑量為550 mg/m2時心臟毒性發生率為7%，累積劑量為700 mg/m2時發生率為18%[3]。充分證據顯示，多柔比星可明顯增加心肌細胞自由基產量，損害細胞抗氧化酶活性，進而引起細胞損傷[4]。

葛根素(8-β-D-葡萄吡喃糖-4',7-二羥基異黃酮)，是從葛根中提取的一種糖苷化合物[5]。它是一種在中國、日本、韓國和東南亞等國家和地區廣泛用于治療心絞痛、心肌梗死和其他心臟癥狀的傳統中草藥[6]。以前的研究表明，葛根素可以增加冠狀動脈血流量，降低心肌耗氧量并可以減輕心血管疾病患者和動物的心肌缺血再灌注損傷[7]。然而，關于葛根素對多柔比星引起的心臟毒性的研究很少且機制尚未完全闡明。

以往研究證實，葛根素具有強烈的抗氧化活性，并可通過抑制氧化應激損傷緩解腎損傷[8]、肝損傷[9]、心肌缺血再灌注損傷[10]等多種疾病。此外，最新研究表明，葛根素具有潛在的抗凋亡作用[11]。因此，我們假設葛根素可通過減少心肌細胞凋亡和(或)氧化應激損傷來緩解多柔比星引起的急性心肌損傷。此外，葛根素發揮心肌保護作用的具體分子信號機制也需進一步探究。

材料和方法

1 主要試劑和實驗動物 葛根素(Sigma公司)；DOX(Cayman公司)；抗β-actin抗體(CST公司)；抗SIRT3、Ac-SOD2抗體(Abcam公司)；抗SOD2抗體(Santa-Cruz公司)；羊抗兔、羊抗鼠二抗(北京中杉金橋公司)；DHE染料(Invitrogen公司)；乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。雄性C57小鼠，體重22～25 g，8周齡，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供。

2 研究方法

2.1 動物模型的建立:如前所述[12]，單次腹腔注射多柔比星(15 mg/kg，溶于生理鹽水)以誘導小鼠急性心臟毒性。對照組小鼠腹腔注射等容量生理鹽水(0.2 ml)。

2.2 實驗分組及給藥方式:將90只C57BL/6小鼠隨機分為六組，每組15只，即正常組(Control組)、單純葛根素處理組(Pue組)、多柔比星處理組(DOX組)、多柔比星+葛根素處理組(DOX+Pue組)、3-TYP+多柔比星+葛根素(3-TYP+DOX+Pue)組；3-TYP+多柔比星(3-TYP+DOX)組。通過腹腔注射葛根素，給藥劑量為10 mg/(kg·d)，給藥5 d。SIRT3選擇性抑制劑3-TYP(50 mg/kg，溶解于生理鹽水)在多柔比星給藥前3 d每日腹腔注射1次，共3次。

2.3 在體心臟血流動力檢測:多柔比星處理5 d后，剔除小鼠頸前毛發。通過右頸總動脈插管檢測等容收縮期左心室內壓力上升的最大速率(The maximum rate of upward pressure in the left ventricle，+dp/dt)和等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(The maximum rate of left ventricular pressure drop，-dp/dt)，具體操作方法參考以往文獻[12]。

2.4 心肌組織凋亡檢測和HE染色:多柔比星處理5 d后，取心臟，并將心臟置于10%福爾馬林中固定24 h。制備石蠟塊并切成5 μm的厚度；如以往文獻所述方法[13]，用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定(TUNEL)試劑盒(Roche Molecular Biochemicals公司，德國)測量心肌細胞凋亡情況。細胞凋亡指數表示為凋亡細胞核數/計數的細胞核總數×100%。此外，將5 μm厚的心臟組織切片進行蘇木精-伊紅(HE)染色以觀察心臟病理改變。

2.5 心肌組織蛋白表達測定:多柔比星處理5 d后，腹腔注射氯胺酮(85 mg/kg)和木聚糖(12.5 mg/kg)，再將實驗動物安樂死。打開胸腔，取出心臟。用生理鹽水洗滌心臟以除去殘留的血液，將心臟組織用液氮冷凍，隨后在-80 ℃冰箱中儲存。將冷凍的組織解凍并使用勻漿器在PBS緩沖液(pH 7.4)中勻漿。將上清液分成2～3份，置于分開的管中，并再次儲存在-80 ℃。用BCA蛋白定量試劑盒檢測各組樣品蛋白濃度。用10%Bis/Tris凝膠分離各組樣本蛋白，并用濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h，室溫下孵育抗SIRT3(1∶1000)、Ac-SOD2(1∶1000)、SOD2(1∶500)和β-actin(1∶1000)抗體2 h；TBST洗滌3次；室溫孵育羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶5000)2 h；用TBST洗滌3次。使用BioRad成像系統檢測條帶并進行蛋白半定量分析。

2.6 心肌組織氧化應激水平測定:多柔比星處理5 d后，將液氮冰凍的心臟組織切成10 μm厚度的冰凍切片，按照試劑說明書進行DHE染色，熒光顯微鏡拍照并用Image Pro-Plus軟件進行熒光強度分析。此外，將冰凍的心肌組織化凍后以心肌組織(g)和生理鹽水(ml)1∶9的比例制作組織勻漿。按照MDA檢測試劑盒說明書檢測襲擊組織內MDA含量。

結果

1 葛根素處理改善多柔比星引起的急性心臟毒性

心肌細胞空泡變性是DOX誘導的心臟毒性中心肌細胞損傷的重要標志。Control組小鼠心肌細胞幾乎沒有檢測到空泡變性，而DOX處理組小鼠空泡變性明顯增加。與DOX組相比，葛根素處理可以明顯抑制小鼠心肌細胞空泡變性。與Control組相比，單純給予葛根素不會引起心肌細胞發生空泡變性(圖1A)。此外，我們使用LDH檢測試劑盒通過反射光譜法檢測了各組小鼠血清LDH活性。結果顯示，與Control組小鼠相比，DOX組小鼠血清內LDH(心肌損傷的重要血清標志物)活性顯著上升，而給予葛根素處理可以明顯降低LDH活性(P<0.01，圖1B)。小鼠多柔比星給藥5 d后檢測各組小鼠心臟收縮和舒張功能。如圖1C-D所示，與Control組小鼠相比，DOX組小鼠心臟收縮和舒張功能明顯受損，表現為+dp/dt與-dp/dt明顯降低(P<0.01)。與DOX組相比，葛根素處理后能明顯提高+dp/dt與-dp/dt(P< 0.01)。與Control小鼠相比，單純給予葛根素對小鼠心臟收縮和舒張功能無明顯影響(P>0.05)。綜上所述，這些數據表明葛根素可有效緩解DOX誘導的急性心臟毒性。

2 葛根素處理抑制多柔比星引起的心肌氧化應激損傷 小鼠腹腔注射多柔比星5 d后檢測各組小鼠心肌組織內ROS產量。結果顯示，與Control組小鼠相比，DOX組小鼠心肌組織內ROS產量明顯增加，而葛根素處理可以明顯降低ROS產量(P<0.01)。與Control組小鼠相比，單純給予葛根素處理對心肌組織ROS產量無明顯影響(P>0.05)。此外，DOX也可明顯增加心肌組織內脂質過氧化產物MDA含量，而葛根素可以明顯降低MDA含量(P<0.01)。與Control組小鼠相比，單純給予葛根素對心肌組織MDA含量無明顯影響(P>0.05,圖1E-F)。

3 葛根素處理抑制多柔比星引起的心肌凋亡 小鼠腹腔注射多柔比星5 d后檢測各組小鼠心肌細胞凋亡情況。結果顯示，與Control組小鼠相比，DOX組小鼠心肌細胞凋亡率明顯增加，而葛根素處理可以明顯降低心肌細胞凋亡率(P<0.01)。與Control組小鼠相比，單純給予葛根素處理對心肌細胞凋亡率無明顯影響(P>0.05,圖1G-H)。

A：各組小鼠左室心肌HE染色圖(400×)；B：血清乳酸脫氫酶(LDH)水平；C：等容收縮期左心室內壓力上升的最大速率(+dp/dt)；D：等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(-dp/dt)；E：活性氧(ROS)產量；F：丙二醛(MDA)含量；G：TUNEL染色(400×)，標尺為100 μm；H：凋亡率。**P< 0.01，與DOX組相比,△△P<0.01

圖1 葛根素處理對多柔比星急性心臟毒性的影響(n=6)

4 葛根素處理可激活多柔比星處理后心肌組織內SIRT3/SOD2信號通路 小鼠腹腔注射多柔比星5 d后檢測各組小鼠心肌組織內SIRT3/SOD2信號通路相關蛋白表達情況。我們發現，與Control小鼠相比，DOX組小鼠心肌組織中SIRT3的表達量明顯下降，而Ac-SOD2的表達量明顯增高(P<0.01)。與DOX組相比，葛根素處理可以明顯提高心肌組織內SIRT3的表達，降低Ac-SOD2的表達(P<0.01)。與Control相比，單純給予葛根素處理對SIRT3和Ac-SOD2蛋白表達水平無明顯影響(圖2，P>0.05)。

A：Western blot條帶；B：SIRT3表達水平；C：SOD2乙酰化水平。與Control相比，**P<0.01;與DOX組相比,△△P<0.01

5 阻斷SIRT3/SOD2信號通路逆轉葛根素對多柔比星心臟毒性的保護作用 為了驗證SIRT3/SOD2信號通路是否介導葛根素對多柔比星心臟毒性的保護作用，我們通過3-TYP特異性地抑制SIRT3的活性。與DOX+Pue組相比，3-TYP處理可以明顯增加心肌細胞空泡變性程度，增加血清內LDH活性，惡化小鼠心臟收縮和舒張功能，增加心肌組織內ROS產量和MDA含量，增加心肌組織凋亡率(P均<0.05)。與DOX組相比，單純給予3-TYP對DOX處理后心肌組織的上述指標無明顯影響(P> 0.05)。見圖3。

A：各組小鼠左室心肌HE染色圖(400×)；B：血清乳酸脫氫酶(LDH)水平；C：等容收縮期左心室內壓力上升的最大速率(+dp/dt)；D：等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(-dp/dt)；E：活性氧(ROS)產量；F：丙二醛(MDA)含量；G：TUNEL染色(400×)，標尺為100 μm；H：凋亡率。與DOX組相比，△/△△P<0.05/0.01，與DOX+Pue組相比,#/##P<0.05/0.01。

圖3 抑制SIRT3/SOD2信號通路對葛根素心肌保護作用的影響(n=6)

討論

多柔比星目前仍是臨床上廣泛使用的一種強效廣譜化療劑，可用于治療多種癌癥[1-2]。然而，許多副作用限制了它的臨床療效。心臟毒性是多柔比星的主要副作用，這種現象在臨床患者和動物研究中均已被證實[3, 14]。探尋有效的心臟保護劑緩解多柔比星誘導的心臟毒性對于改善腫瘤患者預后有重要的臨床意義。

葛根素是從葛根中提取的一種糖苷化合物[5]。充分研究證實，葛根素具有明顯的心肌保護作用。李靜等[15]證實，葛根素可以顯著改善冠心病穩定型心絞痛患者臨床癥狀和心電圖表現，延緩動脈粥樣硬化進程。行海艦[16]進一步發現，葛根素聯合左卡尼汀可有效降低小兒病毒性心肌炎患者心肌酶水平，改善患者預后。Shao等[17]發現，葛根素對于膿毒癥引起的心臟損傷也發揮了重要的保護作用，其作用的發揮與抑制炎癥反應有關。Liu等[18]證實，葛根素可改善嚴重燒傷引起的心肌損害。此外，以往研究證實，葛根素能夠改善多柔比星引起的心臟毒性[19]，但具體機制尚未完全闡明。值得注意的是，葛根素在多種疾病中都發揮了抗氧化應激和抗凋亡的作用。Wang等[20]證實，葛根素能夠明顯減輕創傷性腦損傷誘發的氧化應激損傷。Li等[21]發現，葛根素能夠抑制糖尿病大鼠血管組織氧化應激損傷進而改善糖尿病引起的主動脈損傷。Zhou 等[8]證實，葛根素通過抑制氧化應激進而減輕內皮細胞凋亡，最終改善單側輸尿管梗阻引起的腎臟纖維化反應。在本研究中，我們發現，多柔比星處理后小鼠心肌組織內ROS產量和MDA含量明顯增高，伴隨心肌凋亡率明顯上升。葛根素處理可以有效抑制多柔比星引起的氧化應激損傷和凋亡。綜上，葛根素發揮抗多柔比星心臟毒性心肌保護作用與其抗氧化和抗凋亡活性密切相關。

Sirtuin是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的組蛋白去乙酰化酶家族，從細菌到人類均高度保守，共有SIRT1-7七個成員[22]。沉默信息調控因子3(Silent information regulator 3，SIRT3)是線粒體內最主要的去乙酰化酶，近些年來，越來越多證據顯示，SIRT3是機體重要的內源性心肌保護分子。下調SIRT3表達可導致心肌細胞和成人心臟對缺血再灌注損傷的敏感性增加，并可能加劇老年心臟的心肌缺血再灌注損傷[23- 24]。Zhai等[25]發現，褪黑素可以通過激活SIRT3改善心肌缺血再灌注損傷。Guo等[26]證實，Angiotensin-(1-7)可以通過激活SIRT3逆轉血管緊張素II引起的心肌肥厚。特別值得注意的是，最新證據顯示，激活SIRT3可明顯緩解由多柔比星引起的心臟毒性[27]。在本研究中，我們發現，多柔比星處理可以明顯下調心肌組織中SIRT3的表達，進而上調SOD2的乙酰化水平。而葛根素處理可以明顯上調SIRT3的表達，下調SOD2的乙酰化水平。值得注意的是，SIRT3也是機體內抵抗氧化應激損傷和凋亡的重要分子。研究發現，SIRT3是調節線粒體谷胱甘肽抗氧化防御系統的重要分子，可以延緩氧化應激引起的聽覺喪失[28]。激活SIRT3能夠減輕缺血再灌注引起的心肌細胞凋亡[25]。在本研究中，我們發現，抑制SIRT3信號通路可以明顯減弱葛根素的心肌保護作用，具體體現在3-TYP處理可以明顯增加多柔比星處理后心肌細胞空泡變性程度，增加血清內LDH活性，損害小鼠心臟收縮和舒張功能，增加心肌組織內ROS產量和MDA含量，增加心肌組織凋亡率。

綜上所述，我們的研究首次證實葛根素處理能夠明顯改善多柔比星引起的心臟毒性，其具體作用機制為激活SIRT3/SOD2信號通路進而抑制氧化應激損傷和心肌凋亡。我們的研究為臨床上應用葛根素治療多柔比星心臟毒性提供了新的理論依據。