針織蠶絲網(wǎng)力學(xué)與生物相容性及皮下埋植實(shí)驗(yàn)*

李躍中，楊亞冬，唐靚，張文元

（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 1.保健食品研究所；2.生物工程研究所，浙江 杭州 310013）

找到合適的生物支架材料是組織工程韌帶/肌腱的關(guān)鍵。天然蠶絲絲素纖維具有較強(qiáng)的耐疲勞性能[1-3]，綜合力學(xué)性能遠(yuǎn)優(yōu)于通常的合成纖維，具有與韌帶/肌腱相似的力學(xué)性能、良好的生物相容性能和加工性能。

緯編針織的網(wǎng)狀支架具有充足的力學(xué)性能，伸縮性和柔軟性良好[4]。具有高孔隙率、多空間、利于細(xì)胞的接種及空氣交換的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)緯編針織蠶絲纖維網(wǎng)狀支架，進(jìn)行機(jī)械性能測(cè)試及其與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外共培養(yǎng)評(píng)價(jià)；并進(jìn)行皮下埋植實(shí)驗(yàn)，觀察其組織相容性及力學(xué)性能變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要器材和試劑

桑蠶絲（Bombyx Mori silk）購(gòu)于杭州絲綢市場(chǎng)。I型鼠尾膠原（杭州生友生物技術(shù)有限公司），纖維連接蛋白（Fibronectin, Sigma），低糖-DMEM（Gibco），胎牛血清（杭州四季青）。掃描電鏡（SU8010，日本HITACHI公司），拉力機(jī)（QXW300，上海企想檢測(cè)儀器有限公司），冷凍干燥機(jī)（LL3000，丹麥HetoPowerDry公司），二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（Thermo Electron Corporation,HEPA class 100，美國(guó)Merlette公司），倒置相差顯微鏡（CKX41，日本Olympus公司）。新西蘭白兔共7只，3個(gè)月齡，雌性，體重約2 kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（浙）2013-0055號(hào)，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供與飼養(yǎng)。

1.2 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）提取及純化

按參照文獻(xiàn)[5]先通過(guò)密度梯度離心法提取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs），再通過(guò)貼壁培養(yǎng)法純化BMSCs。

1.3 蠶絲絲素纖維網(wǎng)狀支架的制備

按參照文獻(xiàn)[6]將蠶絲用0.5%碳酸鈉（Na2CO3）溶液煮沸2次，每次30 min，得到脫膠的蠶絲絲素纖維。再將蠶絲絲素纖維單絲200根，逆時(shí)針扭合（2捻）成一小束（含蠶絲絲素纖維單絲400根）。按圖2A將纖維小束通過(guò)緯編針織成長(zhǎng)條網(wǎng)狀支架（長(zhǎng)2.5 cm×寬0.5 cm）。按參照文獻(xiàn)[6]清洗干凈。取一根網(wǎng)狀支架，經(jīng)噴金后用掃描電鏡（scanning electron microscope, SEM）觀察其微觀形貌。

1.4 蠶絲絲素溶液的制備

將“1.3”項(xiàng)下制備的脫膠蠶絲絲素纖維剪小剪碎，置于三元溶液中（摩爾比CaCl2︰H2O︰C2H5OH=1︰8︰2），80℃，600 r/min，恒溫磁力攪拌器攪拌溶解，脫泡，置于透析袋中用去離子水透析3 d，得到蠶絲絲素溶液，經(jīng)濃縮后配制成2%蠶絲絲素溶液。

1.5 蠶絲網(wǎng)/膠原-絲素海綿復(fù)合支架的制備

5 mg/ml濃度的I型鼠尾膠原用0.1 mol/L氫氧化鈉（NaOH）中和后，與等體積的2%蠶絲絲素溶液混勻，滴加于“1.3”項(xiàng)下制備的蠶絲網(wǎng)上，低溫冰箱過(guò)夜，凍干2 d，環(huán)氧乙烷消毒。取一根網(wǎng)狀支架，SEM觀察。

1.6 蠶絲絲素纖維緯編針織網(wǎng)的機(jī)械性能檢測(cè)

取8個(gè)長(zhǎng)2.5 cm×寬0.5 cm的蠶絲絲素纖維緯編針織網(wǎng)狀支架樣品（“1.3”項(xiàng)下制備，不含膠原-絲素海綿），參照文獻(xiàn)[6]用拉力機(jī)進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試。將試樣固定于拉力機(jī)上，拉力至2 N時(shí)測(cè)試樣橫截面積及夾具間距長(zhǎng)度，再以拉伸速度50 mm/min進(jìn)行拉力試驗(yàn)，記錄最大載荷、拉伸強(qiáng)度及彈性模量等力學(xué)指標(biāo)。

1.7 支架-BMSCs復(fù)合物的體外培養(yǎng)

將已消毒的蠶絲網(wǎng)/膠原-絲素海綿支架浸入200 μg/ml的纖維連接蛋白溶液中，4℃靜置24 h，常溫晾干。將第3代BMSCs（1×107/ml）接種到支架上，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱放置2 h，加足培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后，戊二醛固定，鋨酸固定，梯度乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金，SEM觀察。

1.8 蠶絲網(wǎng)皮下埋植實(shí)驗(yàn)

3個(gè)月齡健康新西蘭白兔5只，3%戊巴比妥鈉1.1 ml/kg（即33 mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉，于背中偏下脊柱兩側(cè)進(jìn)行脫毛、消毒、鋪巾，無(wú)菌條件下，在兔背部中段偏下脊柱兩側(cè)各作一個(gè)長(zhǎng)約2.5 cm的切口，兩側(cè)間距4 cm，切開(kāi)背部皮膚，鈍性分離皮下組織，用止血鉗沿肌纖維長(zhǎng)軸走向輕輕分開(kāi)脊柱兩側(cè)骶棘肌肌纖維成肌袋，每側(cè)各做一個(gè)。每個(gè)肌袋植入蠶絲網(wǎng)（“1.3”項(xiàng)下制備，已環(huán)氧乙烷消毒，長(zhǎng)2.5 cm×寬0.5 cm，不含膠原-絲素海綿）一條，即每只兔子植入兩條蠶絲網(wǎng)，保持材料縱軸與肌纖維方向一致，縫合肌膜，然后縫合皮膚。青霉素連續(xù)注射3 d，每只實(shí)驗(yàn)兔50 萬(wàn)單位/d。每只兔單籠飼養(yǎng)，每天觀察兔子的飲食、活動(dòng)、生長(zhǎng)、傷口反應(yīng)及愈合情況。于術(shù)后3個(gè)月，用戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉方法將5只動(dòng)物全部處死，按原切口入路，取出植入的蠶絲網(wǎng)，觀察大體形狀變化及其周?chē)∪馇闆r。共有10個(gè)試樣，其中2個(gè)試樣連同周?chē)募∪饨M織取出，經(jīng)固定、包埋后，橫截面切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin stain, HE）染色、馬松（Masson）染色觀察。另外8個(gè)試樣剔除附著的肌肉組織，清洗后于濕潤(rùn)條件下按“1.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs培養(yǎng)及傳代

骨髓經(jīng)密度梯度離心及貼壁培養(yǎng)后獲得BMSCs。通過(guò)原代、傳代培養(yǎng)后，BMSCs生長(zhǎng)旺盛，呈長(zhǎng)梭形旋渦生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

圖1 第3代BMSCs呈長(zhǎng)梭形旋渦生長(zhǎng)（100×）

2.2 蠶絲絲素纖維網(wǎng)狀物的SEM觀察結(jié)果

蠶絲絲素纖維緯編針織網(wǎng)狀物的SEM觀察到蠶絲網(wǎng)狀物有較大的孔隙，伸縮性和柔軟性良好，見(jiàn)圖2B。蠶絲網(wǎng)狀物滴加膠原-絲素溶液并凍干后，成海綿狀，見(jiàn)圖2C。

2.3 蠶絲網(wǎng)狀支架的機(jī)械性能測(cè)定

未經(jīng)埋植的蠶絲網(wǎng)狀支架的最大載荷、拉伸強(qiáng)度、彈性模量分別為（110.53±14.60）N、（41.88±5.51）MPa、（199.08±26.14）MPa。

2.4 BMSCs在支架上生長(zhǎng)的SEM觀察情況

復(fù)合培養(yǎng)2 d，BMSCs附于蠶絲網(wǎng)充填膠原-絲素海綿支架生長(zhǎng)，增殖良好，呈立體生長(zhǎng)，圖2D。

2.5 蠶絲網(wǎng)皮下埋植實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 大體觀察 術(shù)后動(dòng)物均存活至實(shí)驗(yàn)完成，進(jìn)食、排泄和活動(dòng)正常。

2.5.2 組織學(xué)觀察 蠶絲網(wǎng)埋植3個(gè)月后，未見(jiàn)有明顯降解。經(jīng)HE染色、Masson染色，可見(jiàn)支架與周?chē)M織的組織相容性良好，可見(jiàn)有肌肉長(zhǎng)入蠶絲網(wǎng)支架，產(chǎn)生膠原，見(jiàn)圖3A、圖3B。

圖3 蠶絲網(wǎng)埋植3個(gè)月后的組織學(xué)觀察（×400）

2.5.3 埋植后蠶絲網(wǎng)的力學(xué)性能測(cè)試 兔子皮下埋植3個(gè)月后，蠶絲網(wǎng)的最大載荷、拉伸強(qiáng)度、彈性模量分別為（74.85±11.36）N、（28.84±4.39）MPa、（130.79±19.87）MPa。

3 討論

天然蠶絲絲素纖維堅(jiān)韌無(wú)比，強(qiáng)伸性好，具有優(yōu)良的力學(xué)性能[7]能在體內(nèi)外長(zhǎng)期保持其優(yōu)良的機(jī)械性能[8]，能滿足韌帶/肌腱的強(qiáng)力要求，蠶絲絲素纖維已作為有吸引力的生物材料，且蠶絲絲素具有良好的生物相容性[9]及低免疫原性[10]，有望用于制作組織工程韌帶/肌腱[11-12]。由于蠶絲再生絲素是將天然蠶絲絲素纖維溶解、消化后獲得的蛋白，有一些化學(xué)鍵已被打斷，所以再生絲素更加容易降解。許多研究結(jié)果表明，天然蠶絲纖維的降解速率明顯慢于再生蠶絲絲素材料（例如再生絲素海綿、膜或多孔材料）[13-15]。膠原-再生蠶絲絲素海綿填充預(yù)留細(xì)胞生長(zhǎng)空間，以適于種子細(xì)胞的生長(zhǎng)。膠原最先降解，再生蠶絲絲素海綿次之，天然蠶絲絲素纖維最后降解，以實(shí)現(xiàn)梯度降解，為肌腱和韌帶組織工程支架開(kāi)發(fā)帶來(lái)新的契機(jī)。與傳統(tǒng)的韌帶/肌腱修復(fù)材料相比，基于蠶絲材料的組織工程韌帶/肌腱具有原料來(lái)源充足、組織相容性好、生物力學(xué)性能好、可塑性強(qiáng)及可永久性替換缺損韌帶/肌腱等優(yōu)點(diǎn)，是目前的研究熱點(diǎn)[16-17]。因此，絲素蛋白有很大的轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的潛力。大量研究證實(shí)，BMSCs具有分化為各種間葉質(zhì)系的潛力，包括成纖維細(xì)胞以及骨原性、軟骨原性和肌原性細(xì)胞的潛力。此外，BMSCs已經(jīng)有效地應(yīng)用于骨骼肌、軟骨及骨骼組織的修復(fù)，尤其在骨骼[18]、肌腱[19]和韌帶[20]。

蠶絲絲素纖維緯編針織網(wǎng)支架的空隙被膠原-再生絲素海綿所占據(jù)，為細(xì)胞提供了一個(gè)附著點(diǎn)，而不致于從支架空隙中漏掉。在纖維上吸附蛋白質(zhì)對(duì)于提高細(xì)胞的控制和引導(dǎo)是至關(guān)重要的。筆者前期實(shí)驗(yàn)表明，不經(jīng)表面修飾的蠶絲網(wǎng)/膠原-絲素海綿支架，細(xì)胞容易流失，而經(jīng)纖維連接蛋白表面修飾后，細(xì)胞黏附效果有了較好的改善。本實(shí)驗(yàn)于蠶絲網(wǎng)/膠原-絲素海綿支架上BMSCs培養(yǎng)2 d，細(xì)胞可在支架上黏附，支持BMSCs生長(zhǎng)。

動(dòng)物肌肉埋植實(shí)驗(yàn)是目前國(guó)際上通用的評(píng)價(jià)醫(yī)用材料對(duì)組織毒性刺激的一種重要的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法。結(jié)果表明蠶絲網(wǎng)皮下埋植3個(gè)月后，組織相容性良好，并能保持相當(dāng)強(qiáng)的力學(xué)強(qiáng)度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，蠶絲網(wǎng)狀支架具有良好的力學(xué)性能、細(xì)胞相容性及組織相容性，皮下埋植3 個(gè)月后還具有相當(dāng)強(qiáng)的力學(xué)強(qiáng)度，有望作為組織工程韌帶/肌腱的支架材料。