RNF168在乳腺癌組織中的表達分析*

羅小麗，劉自光，何慧君，吳國標

（南方醫科大學順德醫院 1.病理科；2.乳腺甲狀腺外科，廣東 順德 528300）

關鍵字：乳腺癌；RNF168；免疫組化

乳腺癌是女性群體中最常見的一種癌癥。在我國雖然乳腺癌的發病率和致死率處于相對比較低的水平，但是近幾年出現迅速增長的趨勢。乳腺癌的發生與基因組的不穩定有著密切的關系，而細胞維持基因組穩定是通過各種脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）修復機制，這種DNA修復對于阻止腫瘤的形成和發展很重要[1]。環指蛋白168（ring finger protein 168, RNF168）是一個與雙鏈DNA損傷有關的重要調節蛋白，它主要控制DNA的損傷反應，比如同源DNA重組和非同源DNA修復[2]。這些損傷反應對于維持基因組的穩定和在雙鏈DNA損傷過程中的糾錯發揮著至關重要的作用[2]。正是因為RNF168的這種功能，所以它很可能在乳腺癌的誘發進展過程中起著十分重要的作用。本研究收集至少319個臨床樣本，比較RNF168在癌組織與正常組織以及不同階段癌組織中的表達，確定RNF168與乳腺癌發生發展的關系，從而為乳腺癌的治療提供一個新靶點。

1 資料和方法

1.1 病例收集

收集南方醫科大學附屬順德醫院2013年1 月-2016年1月乳腺癌手術標本319例，319例均為女性；年齡26～79歲，平均（45.6±5.8）歲；病程3個月～2年，平均（1.0±0.2）年；腫瘤直徑為0.5～2.5 cm，平均（1.8±0.4）cm；體重指數（body mass index, BMI）為21～24 kg/m2，平均（22.5±0.5）kg/m2；其中浸潤癌298例，原位癌22例。本研究經南方醫科大學順德醫院倫理委員會審查（批件號：科研倫審20160901）。同時，本次研究內容已告知研究對象知情，并已簽署知情同意書。

1.2 乳腺癌組織分級標準

癌癥患者的癌組織的發展程度由本院病理部門處獲得。根據TNM國際分期標準進行分期，其中I期66例，II期145例，III期96例，IV期12例。

1.3 免疫組化染色法

①標本經3.7%中性福爾馬林固定，常規取材，脫水處理，常規石蠟包埋，4 μm厚切片，常規HE染色，光鏡下觀察。②免疫組織化學方法采用EnVision二步法，滴加過氧化物酶阻斷劑（3%過氧化氫）和動物非免疫血清（羊），小鼠單克隆抗體anti-RNF168購自Abcam（稀釋比例為1︰300），二抗（羊抗鼠/兔IgG聚合物）、DAB均購自邁新。

1.4 RNF168陽性細胞百分比評分方法

染色強度：陰性0分，弱陽性1分，中等陽性2分，強陽性3分；細胞數百分比：小于5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，大于75%為4分。兩者分數相乘得分0～7分為低表達，8～12分為高表達。

1.5 統計學方法

應用醫學統計軟件SPSS 16.0進行數據處理。計量資料以均數±標準差（±s）表示，計量資料行t檢驗。P ＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

免疫組化方法分析RNF168蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達：陽性表達大部分在乳腺癌細胞和癌旁正常乳腺組織導管上皮細胞細胞核，少部分在細胞漿。癌旁正常乳腺組織共68例，其中32例為陰性，36例為陽性，陽性率為53%，且均為低表達。乳腺癌病例共319例，其中24例陰性，295例陽性，陽性率為92%。RNF168在癌組織和癌旁正常組織依據評分標準，其中I期病例陽性高表達占比17/66，II期病例陽性高表達占比78/145，III期病例陽性高表達占比60/96，IV期病例陽性高表達占比9/12。而且，RNF168蛋白在I期和II期的得分明顯高于癌旁正常組織（P =0.001），III期和IV期的得分明顯高于I期和II期（P =0.005），而根據年齡和BMI無法區分RNF168的表達情況，見圖1和表1。

圖1 RNF168在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達圖

表1 乳腺癌患者年齡、BMI和TNM分期的臨床特征統計 （±s，分）

表1 乳腺癌患者年齡、BMI和TNM分期的臨床特征統計 （±s，分）

臨床特征例數RNF168表達(平均分)t值P值年齡/歲

3 討論

乳腺癌是發生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，女性當中最常見的一種癌癥[3]。乳腺癌的發生與基因組的不穩定有著密切的關系，而細胞維持基因組穩定是通過各種DNA修復機制，這種DNA修復對于阻止腫瘤的形成和發展是很重要的[2]。雙鏈DNA的損傷被認為是最重要的一類DNA的損傷[4]。研究表明，雙鏈DNA的損傷與乳腺癌的發生有著密切的關系[5]。

在細胞中，有兩條主要的通路與雙鏈DNA的修復是有關系的，非同源性的末端重組和同源性的重組，這兩條通路的主要不同在于在修復過程中所需要的受損的雙鏈DNA模板不同[6]。同源重組修復受損雙鏈DNA已經被很明確地證明通過識別乳腺癌易感基因，包括BRCA1和BRCA2[7]。但是沒有明確的證據表明非同源的末端連接與乳腺癌的發生有關系。在非同源的末端連接中有關基因中，只有Ligase IV和Artemis這兩個基因被證明與內梅亨綜合征以及聯合免疫缺陷有關系，而其他的基因則沒有發現與腫瘤的發生發展有關[8]?？赡苁且驗榉峭茨┒诉B接主要參與維持基因組的穩定，因為患者缺失了非同源連接有關的基因會造成基因組的不穩定[9]。

BRCA1/2是一類很重要的腫瘤抑制基因，BRCA1/2的突變經常會增加患乳腺癌的幾率[9]。從BRCA1/2被發現開始，后續的對它的研究發現，它可以通過同源重組這條通路來參與修復雙鏈DNA的損傷。雙鏈DNA的損傷可以被多個因素引起，比如缺氧以及紫外線照射等，不正確的損傷修復通常會導致基因組的不穩定以及腫瘤的發生[10]。作為一個腫瘤抑制基因，BRCA1的缺失會引起大約55%～65%的女性患乳腺癌，大約45%的女性如果缺失雙鏈DNA修復基因BRCA2到70歲時會出現乳腺癌[10]。BRCA1/2蛋白的功能是基于自身結構的，主要由兩部分組成，RING區域主要是作為E3s泛素鏈接酶；BRCT區域是一個磷酸化蛋白結合位點，特異性結合ATM/ART激 酶[11]。

研究表明，BRCA1缺失的細胞中RNF168可以通過泛素化H2A/H2AX抑制同源重組對受損雙鏈DNA的修復[12]；還有研究表明，在BRCA1缺失的細胞中，RNF168-R57依賴的組蛋白的泛素化對抑制同源重組對雙鏈DNA的修復起重要作用[13]。說明RNF168可以通過泛素化來影響DNA損傷反應，同時也說明BRCA1可以抑制RNF168的這種影響。

RNF168有一個N末端RING手指區域，3個泛素結合區域和兩個與泛素相互作用的序列，研究表明RNF168通路在介導DNA損傷過程中發揮著重要作用。RNF168通過識別位于受損DNA兩側的被RNF8泛素化的非核小體蛋白而結合在DNA的受損部位[14]。通過泛素結合酶UBC13，RNF168開始啟動組蛋白H2A以及H2AX的泛素化，從而導致DNA受損反應蛋白聚集到DNA損傷的部位[15]。雖然RNF8以及H2AX在DNA受損反應蛋白聚集的過程中發揮了重要的作用，但是研究表明，在沒有RNF8以及H2AX存在的情況下，DNA受損蛋白仍然會聚集到DNA受損部位[16]。相反，在RNF168缺失的小鼠成纖維細胞中，53BP1在DNA受損部位的聚集就發生了障礙，這表明，RNF168除了在DNA損傷的通路H2AX-MDC1-RNF8這條通路中發揮作用外，還可以自己獨立地發揮作用。RNF168在53BP1聚集在DNA損傷部位之前就將其泛素化，這對53BP1啟動DNA損傷反應有著重要的影響[17]。

綜上所述，RNF168可以通過泛素化DNA損傷反應蛋白53BP1來減弱DNA損傷反應，從而使DNA修復受阻。RNF168的缺失可以降低其引起的泛素化效應，從而使腫瘤抑制因子53BP1能夠不被降解，從而發揮腫瘤抑制作用[18]。因此從理論上講，RNF168起著潛在的可以影響乳腺癌發生發展的作用，可能與乳腺癌的發展有著密切的聯 系。

本研究通過免疫組織化學的方法比較319例乳腺癌患者RNF168蛋白的表達，可以看出，RNF168的表達量隨著乳腺癌發展程度越來越高。這說明隨著乳腺癌的發展，RNF168逐漸積累，使機體對抗DNA損傷的反應越來越弱，從而使癌癥向著越來越惡化的方向發展。這說明，RNF168對乳腺癌的發展起著重要的作用，進而說明，RNF168可以作為判斷乳腺癌發展程度的一個指標，或許可以作為治療乳腺癌的一個靶點。關于RNF168如何影響乳腺癌發生發展的認識現在還不是很清楚，目前只知道它可以通過泛素化影響DNA損傷的修復。筆者相信，隨著對RNF168在乳腺癌中的作用的深入研究，可以更好地了解乳腺癌在早期發生的機制，從而更好地為治療乳腺癌提供更多選擇。