胎兒游離DNA無創產前篩查假陰性病例分析

袁路，張富青，劉敏，楊黎明，張華，劉超，陳菲

（河南省鄭州市婦幼保健院 優生遺傳科，河南 鄭州 450012）

1997年，Lo等[1]發現孕婦外周血中存在游離胎兒脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA），隨著高通量測序技術的發展，無創產前篩查（nininvasive prenatal screening, NIPS）在產前篩查染色體非整倍體的高靈敏性和特異性迅速應用于臨床[2]。基于介入性產前診斷的胎兒丟失風險，孕婦更愿意接受NIPS，許多研究中心嘗試將NIPS逐步擴展到性染色體和拷貝數變異（copy number variations, CNVs）的檢測。本中心NIPS對于胎兒21-三體、18-三體、13-三體的檢出率為100%[3]，但在染色體微缺失綜合征的檢測中存在2例假陰性病例，通過對假陰性病例進行回顧分析，探討NIPS在臨床中的規范化應用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

孕婦1，34歲，G2P1，育1子體健，孕10 周因先兆流產保胎治療，孕12+5周因超聲提示右側脈絡叢囊腫（3.9 mm×1.6 mm）選擇做NIPSPLUS，超聲晚期系統篩查提示：胎兒透明隔腔增寬（13 mm），小腦半球形態欠飽滿，小腦蚓部較小，后顱窩池臨界值（8 mm），未進行進一步的遺傳咨詢及產前診斷。胎兒出生后發現左手大拇指內收、雙耳不對稱、吞咽困難及飲奶后鼻腔反流等，見表1。孕婦2，45歲，G2P1，育1女體健，因高齡選擇做NIPS-PLUS，孕晚期進行性羊水增多，未進行進一步的遺傳咨詢及產前診斷。胎兒因胎心監護異常于34+3周剖宮產娩出，出生后發現有新生兒休克、新生兒肺炎、雙側隱睪及顱內出血等，見表2。

表1 孕婦1及新生兒1影像學檢測結果

表2 孕婦2及新生兒2影像學檢測結果

1.2 方法

對新生兒1的外周血使用高通量測序法進行染色體拷貝數變異檢測，后用單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNP）分型芯片檢測進一步驗證。對新生兒2的外周血采用多重連接探針擴增技術（multiplex ligationdependent probe amplification, MLPA）結合毛細管電泳方法分析染色體15q11-13區段內Prader-Willi綜合征/Angelman綜合征（Prader-Willi syndrome/Angelman syndrome, PWS/AS）相關基因TUBGCP5、NIPA1、MKRN3、MAGEL2、NDN-1、SNRPN、UBE3A、ATP10A、GABRB3、APBA2、MLH1及BLM等基因位點的拷貝數情況和甲基化狀態。

2 結果

孕婦1 NIPS-PLUS結果低風險，新生兒1高通量測序結果為seg[hg19]del(1)(p36.33p36.23)，存在8.02Mb缺失，見圖1。SNP結果為arrg[hg19]1p 36.33p36.23(752566-8774451)×1，存在8.02Mb缺失，為1p36缺失綜合征，見圖2。

圖1 新生兒1 DNA拷貝數的高通量測序結果

孕婦2 NIPS-PLUS結果低風險，新生兒2 MLPA結果為PWS/AS相關基因存在拷貝數減半及完全甲基化狀態，為父源性雜合缺失的Prader-Willi綜合征，見圖3。

圖2 新生兒1 SNP芯片驗證結果

圖3 新生兒2 MLPA檢測結果

3 討論

2016年7年美國醫學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）發表聲明：NIPS在21、18、13-三體綜合征篩查方面可以替代傳統的篩查技術[4]。為規范孕婦外周血胎兒游離DNA產前篩查工作，2016年11月國家衛生和計劃生育委員會頒布了《孕婦外周血游離胎兒DNA產前篩查與診斷技術規范》（簡稱《規范》）。

總結分析本中心11 067例孕婦結果，總體檢出率為：98.2%，復合假陽性率：0.4%，復合陽性預測值：69.1%，復合假陰性率：1.7%，符合《規范》要求的質量控制要求。其中21-三體的陽性預測值為100%，18-三體的陽性預測值為94%，與多個中心研究結果一致[5-8]，均顯示NIPS對21-三體和18-三體檢測的準確性較高。而NIPS在13-三體的檢測效能低于21-三體和18-三體，13-三體的陽性預測值為40%。

本研究中2例假陰性病例中1例為1p36缺失綜合征，1例為Prader-Willi綜合征，均為染色體微小片段缺失引起的疾病。由于存在母體體細胞嵌合、限制性胎盤嵌合及胎兒胎盤嵌合等生物學因素[9-11]，使游離胎兒DNA檢測結果有時與實際情況不符[12]。

孕婦1孕12周超聲提示右側脈絡叢囊腫（3.9 mm×1.6 mm），按照《規范》應選擇產前診斷技術進一步檢查，遺傳咨詢后要求進行NIPSPLUS檢測，NIPS-PLUS提示低風險。在孕32周超聲提示多結構異常時，過度依賴NIPS結果，未進一步產前診斷。

孕婦2為高齡45歲，在《規范》中為慎用人群，應直接進行產前診斷，孕婦本人要求做NIPSPLUS。因NIPS-PLUS提示低風險，在孕晚期胎兒發育偏大、進行性羊水增多時未引起重視，未做產前診斷。

限于現有的技術條件，NIPS也存在假陽性和假陰性的可能。醫務人員要嚴格按照《孕婦外周血游離胎兒DNA產前篩查與診斷技術規范》進行遺傳咨詢和檢測。針對NIPS陽性病例必須進行產前診斷確認，以避免假陽性結果導致的孕婦終止妊娠的錯誤決定。對于NIPS陰性病例，要超聲定期隨訪，如發現羊水異常和胎兒結構異常，需要進一步遺傳咨詢和產前診斷。合理規范應用NIPS、超聲影像學技術及產前診斷技術可以早期高效檢出染色體非整倍體胎兒。