食管鱗癌患者放化療前后血清sPD-1和sPD-L1的變化及其臨床意義

鄭志勇，周福有，鄭安平，張耀文，任潤川，金琳芝，程欣宇

（1.河南科技大學 臨床醫學院，河南 洛陽 471000；2.河南省安陽市腫瘤醫院 胸外科，河南 安陽 455000；3.河南省安陽市腫瘤醫院 放療科，河南 安陽 455000）

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，發病率居全部惡性腫瘤第6位，死亡率居全部惡性腫瘤第4位[1]。目前根治性同步放化療是不可手術食管癌的標準治療，但療效不盡人意[2]。B7家族中的程序性死亡受體1（programmed cell death 1, PD-1）及程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）介導的免疫逃逸在腫瘤的發生發展中扮演重要角色[3]。PD-1與PD-L1以膜型和可溶性兩種形式存在。已有研究表明，食管癌組織中PD-L1水平較正常人表達增高，且可以作為患者預后差的獨立預測因子[4]。但食管癌患者血清中可溶性PD-1（sPD-1）和可溶性PD-L1（sPD-L1）的表達水平與食管癌臨床病理特征關系及同步放化療對其表達的影響尚不明確。因此，本研究通過酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測食管鱗癌患者同步放化療前后血清sPD-1和sPD-L1的表達水平并探討其臨床意 義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗組：選取2016年7月-2017年7月安陽市腫瘤醫院行根治性同步放化療食管癌患者46 例。其中男20例，女26例；年齡43～79歲，平均（67.20±8.22）歲。入選所有患者治療前均行食管造影、胸腹部增強CT、頸部彩超、胃鏡及活檢病理證實為食管鱗狀細胞癌，臨床分期參照國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control, UICC）2002年食管癌分期標準，之前未進行過手術、化療、放療或生物治療，無全身免疫系統疾病。正常組：選取同期體檢中心健康體檢者50例，男24例，女26例；年齡43～76歲，平均（65.35±7.67）歲。兩組性別及年齡比較差異均無統計學意義（P ＞0.05）。本研究方案經河南科技大學第四附屬醫院（安陽市腫瘤醫院）倫理委員會批準，并獲得患者知情同意。

1.2 治療方法

放療方案：采用適形調強放療（intensity modulated radiation therapy, IMRT），勾畫靶區：腫瘤體積（gross tumor volume, GTV）根據食道造影、食管鏡檢查所示病變長度、胸部CT掃描的腫瘤部位確定，如果縱隔、鎖骨上或胃左等區域淋巴結轉移則命名為GTVnd，臨床靶區（clinical target volume, CTV）為GTV前后左右外放0.5～0.8 cm，上下各外放3～5 cm，按解剖屏障適當調整，根據病變所在的部位包括相應的淋巴結引流區（食管旁、縱隔1區、2區、4區、5區、7區及賁門、胃左）。計劃靶區（planning target volume, PTV）CTV均勻外放0.5 cm。勾畫危及器官（organ at risk, OAR）：脊髓Dmax≤45 Gy，雙肺V20≤25%～30%，V30≤18%～20%，心臟平均劑量Dmean≤30 Gy。95%PTV處方劑量（50.4～59.4） Gy/（28～33）次，1次/d，5次/周，1.8 Gy/ 次。化療方案：11例患者接受PF方案［氟尿嘧啶750 mg/（m2·d），持續靜滴，第1～5 d，順鉑25 mg/（m2·d），第1～3 d，每3周為1個療程］，18例患者接受TP方案［紫杉醇135 mg/（m2·d），第1 d，順鉑25 mg/（m2·d），第1～3 d，靜脈滴注，每3周為1個療程］，8例患者接受替吉奧+順鉑方案化療［替吉奧80 mg/（m2·d），分兩次口服，第1～14 d，順鉑25 mg/（m2·d），第1～3 d，靜脈滴注，每3周為1個療程］，9例患者接受單藥替吉奧方案化療［替吉奧80 mg/（m2·d），分兩次口服，第1～14 d，每3周為1個療程］。

1.3 標本收集和處理

放化療前后分別抽取靜脈血液5 ml，EDTA-K2抗凝，離心（3 500 r/min）10 min，取上清液，置-80℃冰箱保存待測。

1.4 采用ELISA法檢測血清sPD-1/sPD-L1的含量

使用上海喬羽生物科技有限公司研發的sPD-1/sPD-L1 ELISA試劑盒，按照試劑盒說明書操作，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），sPD-1/sPD-L1濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，通過標準曲線計算樣品中靶蛋白含量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件，計量資料用均數 ±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析；計數資料以百分比（%）表示，計數資料組間比較采用χ2檢驗。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 sPD-1/sPD-L1標準曲線

把標準品的檢測濃度當作橫坐標，OD450值當作縱坐標，繪制出sPD-1/sPD-L1的標準工作曲線，圖1、圖2所示：sPD-1/sPD-L1的濃度與OD450吸光度值之間具有良好的線性關系（R2=0.9989，R2=0.9993）。

圖1 sPD-1的標準工作曲線

圖2 sPD-L1的標準工作曲線

2.2 正常組、實驗組放化療前、放化療結束、放化療結束1個月后血清sPD-1表達情況

正常組、實驗組放化療前、放化療結束、放化療結束1個月后血清中sPD-1水平分別為（587.96±90.37）pg/ml、（605.96±91.45） pg/ ml、（640.96±88.37）pg/ml、（617.83±91.79） pg/ ml。實驗組放化療前血清中sPD-1水平高于正常組（t =2.18，P =0.045）；實驗組放化療結束血清 sPD-1水平高于放化療前（t =-2.30，P =0.026），見圖3。

圖3 正常組、實驗組放化療前、放化療結束、放化療結束1個月后血清sPD-1表達情況

2.3 正常組、實驗組放化療前、放化療結束、放化療結束后1個月血清sPD-L1表達情況

正常組、實驗組放化療前、放化療結束、放化療結束1個月后血清中sPD-L1水平分別為（185.96±29.37）pg/ml、（197.96±32.02） pg/ ml、（217.78±31.99）pg/ml、（212.14±28.32） pg/ ml。實驗組放化療前血清sPD-L1水平高于正常組（t =-2.15，P =0.008）；實驗組放化療結束、放化療結束1個月后血清sPD-L1水平均高于放化療前（t =3.17，P =0.003；t =2.47，P =0.018），見圖4。

圖4 正常組、實驗組放化療前、放化療結束、放化療結束1個月后血清sPD-L1表達情況

2.4 食管鱗癌放化療前血清sPD-1、sPD-L1與臨床病理特征之間的關系

實驗組放化療前血清sPD-1均值為605.96 pg/ ml，≥605.96 pg/ml記作高表達，＜605.96 pg/ml記作低表達。實驗組放化療前sPD-1的表達水平與性別、年齡、腫瘤長度、T分期、N分期及臨床分期無相關性（P ＞0.05），見表1。

實驗組放化療前血清sPD-L1均值為197.96 pg/ml，≥197.96 pg/ml記作高表達，＜197.96 pg/ml記作低表達。實驗組放化療前血清sPD-L1的表達水平與性別、年齡、腫瘤長度、T分期、N分期及臨床分期無相關性（P ＞0.05）。

表1 食管鱗癌血清sPD-1、sPD-L1與臨床病理特征之間的關系 例（%）

2.5 食管鱗癌放化療前血清sPD-1、sPD-L1的水平與總生存期的關系

隨訪截至2018年8月31日，失訪0例，隨訪率100%。隨訪時間為14～26個月，平均隨訪時間（19.81±5.72）個月。

sPD-1高表達組（≥605.96 pg/ml）與低表達組（＜605.96 pg/ml）的1、2年總生存期（overall survival, OS）率分別為：80.0%、58.2%和88.5%、49.4%；中位生存分別為：20.0個月和19.8個月（χ2=0.88，P =0.60）。見圖5。

圖5 sPD-1表達與OS的關系

sPD-L1高表達組（≥197.96 pg/ml）與低表達組（＜197.96 pg/ml）的1、2年OS率分別為：72.2%、32.5%和92.9%、63.6%；中位生存分別為：17.1個月和21.5個月（χ2=0.32，P =0.046）。見圖6。

圖6 sPD-L1表達與OS的關系

3 討論

PD-1是一種抑制性的協同刺激分子，主要表達在激活后的T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、激活的單核細胞、部分樹突狀細胞（dentritic cells,DCs）、自然殺傷性T細胞[5]。PD-1有兩個配體，分別是PD-L1和PD-L2[6]。PD-L1在T、B淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等和一些非淋巴組織上有表達，還有多種細胞在激發后表達PD-L1，一些腫瘤細胞的細胞膜和細胞質也有表達PD-L1[7]。腫瘤細胞逃避T細胞摧毀的一種途徑是通過在它表面產生PD-L1，當免疫細胞T細胞表面的PD-1識別PD-L1后，可以傳導抑制性信號，T細胞就不能發現腫瘤細胞和向腫瘤細胞發出攻擊信號。目前的研究已經證實，包括PD-1和PD-L1在內的多種協同刺激分子是以細胞膜型和可溶性兩種形式存在的。檢測細胞膜型PD-1、PD-L1表達水平需要獲取組織學標本，而sPD-1、sPD-L1表達水平檢測只需獲取血液標本即可，更為簡單便利[8]。

本研究結果顯示，食管鱗癌患者血清中sPD-1和sPD-L1水平較正常人表達升高。郝賀等[9]應用酶聯免疫吸附方法檢測90例食管鱗狀細胞癌患者和40例健康對照者血清中sPD-1、sPD-L1的表達水平。結果顯示：食管鱗癌組血清中sPD-1、sPD-L1水平均明顯高于正常對照組（P ＜0.05）。岳泓旭等[10]用免疫組化法檢測食管癌組及健康體檢組食管組織內PD-L1陽性表達率，結果顯示食管癌組PD-L1陽性表達率明顯高于健康組（P ＜0.05）。以上研究均與本研究結果一致，因此預測sPD-1和sPD-L1可能在食管癌的疾病發展中起到一定的作用。Lim等[11]用免疫組化法檢測食管鱗癌患者新輔助放化療前及術后癌組織PD-L1表達情況，結果顯示新輔助放化療可以上調PD-L1的表達。Zhang等[12]同時對食管癌患者表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、PD-L1表達和放射治療的關系進行了分析，結果發現放射治療可誘導EGFR磷酸化，進而上調PD-L1的表達。這與本研究結果一致。最近的臨床證據表明，PD-L1高表達的腫瘤，抗PD-L1治療效果會更佳[13-14]。因此筆者認為放療若聯合免疫檢查點抑制劑，可能提高食管鱗癌患者的治療效果。

本研究顯示，食管鱗癌血清sPD-1、sPD-L1表達水平與臨床病理特征（性別、年齡、腫瘤長度、T分期、N分期、臨床分期）無顯著相關性（P ＞0.05）。孫莉等[15]研究認為食管鱗癌患者PD-1陽性表達與腫瘤T分期、N分期有關。岳泓旭等[10]研究認為食管癌患者中PD-L1陽性表達率與腫瘤大小、腫瘤T分期及術后病理分期相關。關嵩等[16]研究認為食管鱗癌患者中PD-1/PD-L1陽性表達率與術后淋巴結轉移及pTNM分期有關。這些與本研究結果不一致，可能是因為本研究樣本量較小，尚未顯示出統計學差異。

本研究還發現，sPD-L1高表達的患者與低表達組的1、2年OS率分別為：72.2%、32.5%和92.9%、63.6%（P =0.046），sPD-L1高表達的患者預后較差。Lim等[11]研究共納入73名患者，結果顯示PD-L1高表達的食管鱗癌患者預后較差（中位OS：16.7個月vs. 32.9個月，P =0.02）。Ohigashi等[17]用實時定量PCR法檢測41例食管鱗癌術后標本，最終認為PD-L1高表達水平是患者預后不良的獨立風險因素。

放療與免疫之間存在著非常緊密的聯系，越來越多的研究表明，腫瘤放射治療可以提高腫瘤免疫原性，刺激機體免疫系統對腫瘤抗原的提呈能力，進而起到殺傷腫瘤的作用[18]。放射治療后不僅可以引起腫瘤細胞凋亡和壞死，也可引起腫瘤血管破壞，使腫瘤微環境發生變化，從而可能進一步間接性導致腫瘤細胞死亡。腫瘤發生凋亡或壞死后會釋放許多炎癥介質、趨化因子及危險信號等，從而激活免疫反應[19-20]，因此放療后的腫瘤細胞對全身免疫有重要作用。目前放療與PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑的聯合應用在臨床上還較少，需要筆者通過大量的臨床試驗來證實其有效性，以便更好地應用于臨床實踐。