黃芪糖蛋白對博萊霉素誘導小鼠肺纖維化的干預作用及機制

欒智華 柴智 任晉宏 魏硯明 薛慧清 王瑞 方穎茵 武平

(山西中醫(yī)藥大學實驗中心，山西 晉中 030619)

肺纖維化是以成纖維細胞大量增殖及細胞外基質(zhì)沉積，伴有炎性損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的肺部疾病；損傷異常修復導致肺組織結(jié)構(gòu)異常，是嚴重影響人體肺功能的間質(zhì)性肺病〔1〕。特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病率目前呈上升趨勢，多見于老年人，發(fā)病率男性略高于女性，自確診起，患者中位生存期小于3年。其發(fā)病機制復雜，目前推薦治療方法為糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑治療，但效果不明顯，所以尋找安全有效的治療藥物仍是研究重點。隨著分子生物學的發(fā)展，從分子水平研究中藥及其有效成分的作用靶向已成為研究熱點。黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，黃芪味甘，性溫，歸肺、脾經(jīng)，具有益氣升陽、固表止汗、利水消腫和托毒生肌的功效，是益氣扶正的代表藥物〔2〕。黃芪糖蛋白(HQGP)從傳統(tǒng)中藥膜莢黃芪中提取純化，體外實驗表明其具有一定的免疫抑制作用〔3〕。HQGP具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，但對肺纖維化的作用及其機制鮮見報道。本研究國內(nèi)首次觀察了HQGP干預博萊霉素誘導小鼠肺纖維化的病理改變及肺組織轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1表達。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級雌性ICR小鼠，6～8周齡，體重16～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物使用許可證號：SCXK(京)2016-0011。HQGP由山西中醫(yī)藥大學實驗中心薛慧清教授惠贈。注射用鹽酸博萊霉素，浙江海正輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號16033811。TGF-β1兔抗、即用型鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，均購自武漢博士德生物技術有限公司。全自動半封閉脫水機、輪轉(zhuǎn)式切片機、石蠟冷凍包埋機(德國徠卡)；病理圖文分析系統(tǒng)(Olympus)。

1.2實驗分組 適應性飼養(yǎng)1 w后，將小鼠分為對照組、模型組及治療組。肺纖維化模型參照欒智華等〔4〕的方法，鼻腔滴注博萊霉素造模。建模后第2天起，對照組、模型組腹腔注射0.9%生理鹽水0.2 ml；治療組腹腔注射HQGP，劑量按照1 mg/kg，用0.9%生理鹽水稀釋，0.2 ml，連續(xù)注射14 d。

1.3HE、Masson染色 各組分別于造模后第7、14、28天，每組取材5只，小鼠左肺以4%多聚甲醛固定，進行常規(guī)脫水、透明、包埋，5 μm石蠟組織切片進行 HE及Masson 染色。

1.4免疫組化染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復，滴加單克隆TGF-β1 抗體，于 4℃過夜孵育，DAB顯色，蘇木素染液復染，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察TGF-β1表達。

2 結(jié) 果

2.1HE染色結(jié)果 對照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)無炎性細胞浸潤，肺泡間隔未增厚。模型組第7天可見肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔內(nèi)炎性細胞浸潤，伴有大量出血；第14天見肺泡腔內(nèi)大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，成纖維細胞增殖；第28天大量成纖維細胞增殖、肺纖維化瘢痕形成。與模型組比較，治療組肺組織相應時間點的肺泡炎程度明顯減輕，見圖1。

圖1 各組造模后各時間點肺組織病理學變化(×400)

2.2Masson染色結(jié)果 對照組肺泡間隔有少量膠原纖維分布。模型組肺組織第7天可見染成藍色的膠原纖維沉積，主要集中于終末支氣管壁及肺泡間隔；第14天膠原纖維進一步沉積；第28天肺間質(zhì)中存在大量被染成藍色的膠原纖維，彌漫性纖維化組織形成。與模型組比較，治療組肺組織相應時間點的纖維化程度明顯減輕，見圖1。

2.3各組肺組織TGF-β1表達 TGF-β1陽性表達定位于細胞質(zhì)，對照組細支氣管黏膜上皮細胞、肺泡上皮細胞胞質(zhì)有少量陽性表達；模型組肺組織上皮細胞、巨噬細胞中TGF-β1表達明顯增多；與模型組相比，治療組肺組織相應時間點的肺組織中TGF-β1表明顯減少，見圖2。

圖2 各組造模后各時間點肺組織TGF-β1表達(免疫組化，×400)

3 討 論

肺纖維化是一組由已知或未知原因引起、以肺間質(zhì)慢性炎癥和大量膠原纖維沉積為病理特征的肺部疾病〔5〕，發(fā)病機制不清，且缺乏有效的治療手段。目前除了肺移植，尚無有效的抗纖維化藥物，患者中位生存期僅3～5年〔6〕。目前臨床上主要采用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及抗纖維化制劑來治療肺纖維化，但療效差，安全性低，患者長期應用可出現(xiàn)副作用，故迫切需要開發(fā)新的抗肺纖維化藥物。

糖蛋白是一類由糖類同多肽或蛋白質(zhì)以共價鍵連接而形成的結(jié)合蛋白，廣泛存在于動物、植物和某些微生物中，且存在形式各不相同。山西中醫(yī)藥大學實驗中心從中藥黃芪中提取到一種具有免疫抑制活性的物質(zhì)——HQGP，并已申請專利〔7〕。趙俊云等〔8〕采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)法觀察到HQGP可有效誘導佐劑性關節(jié)炎(AA)大鼠膝關節(jié)滑膜組織的細胞凋亡；章培軍等〔9〕利用HQGP治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)，推測其治療EAE的可能機制是抑制了炎癥反應；張娜等〔10〕研究表明，HQGP對膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)小鼠的治療作用可能是與降低特異性轉(zhuǎn)錄因子T細胞表達的T盒(T-bet)、結(jié)合蛋白(GATA)-3 表達，調(diào)整 Th1/Th2功能失衡有關。

本實驗結(jié)果顯示HQGP對小鼠的肺纖維化具有一定治療作用。TGF-β1 是促進肺纖維化的重要因子，可促進膠原蛋白等細胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積，而導致肺纖維化的產(chǎn)生〔11〕。本文結(jié)果表明，HQGP可以明顯減輕肺纖維化小鼠的肺泡炎及纖維化程度；HQGP可以明顯降低肺組織中TGF-β1的表達，從而延緩肺纖維化的進程，這些作用機制的揭示為指導HQGP開發(fā)及臨床用藥提供了可靠的藥理學依據(jù)。