焦爐工外周血IFN-γ表達及其DNA甲基化的分析

趙慧 高艷榮 宋統球 賈玉巧

014060包頭醫學院公共衛生學院，內蒙古包頭

焦炭制造過程中產生的焦爐逸散物(COEs)成分復雜，其中COEs中的多環芳烴(PAHs)已被國際癌癥研究署(IARC)列為人類確定致癌物，PAHs是一類有毒化合物，有致癌性[1,2]。根據流行病學研究，PAHs與免疫功能受損有關，同時PAHs暴露還會增加肺癌發病風險[3，4]。位于人12號染色體的IFN-γ由淋巴細胞產生，具有抗細菌感染、增強免疫應答及抗腫瘤作用[5]。苯并[a]芘(BaP)是PAHs中重要致癌物，Yanagisawa研究發現鼻內接觸帶有螨蟲過敏原的BaP可誘導脾細胞培養上清液產生IFN-γ細胞因子[6]。Al-Daghri研究結果顯示哮喘患兒IFN-γ mRNA表達和血清PAH水平有顯著相關性[7]。IFN-γ是重要的抗腫瘤免疫細胞因子，Wakita實驗表明缺陷IFN-γ的小鼠，鱗狀細胞癌發生率顯著升高[8]。免疫系統在腫瘤發展中起重要作用。PAHs致癌過程中引起DNA甲基化已被證實在腫瘤中是非常重要的表觀遺傳[9]，但是PAHs職業接觸細胞因子DNA甲基化未有報道。本次實驗研究了解焦爐工職業PAHs暴露與外周血血清IFN-γ表達關系及IFN-γ表觀遺傳機制在多環芳烴暴露損傷中的表現。

資料與方法

選擇包頭某焦化廠煉焦車間85名工人為暴露組，同廠不接觸COEs的輔助車間及行政部門人員47名為對照組。所有研究對象均為男性，漢族，年齡18～60周歲。無明確的心血管、肝、腎、肺及自身免疫等疾病，無濫用藥物史，自愿按照要求參加體檢項目者。暴露組至少在煉焦車間工作1年以上，對照組工齡滿1年且在過去3個月內沒有接觸過COEs。采集暴露組班后尿及對照組工人晨尿30 mL，紫色EDTA抗凝、橘黃色促凝采血管各采集血液標本3 mL。均-80℃存儲，待分析。本研究經包頭醫學院醫學倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意。

問卷調查：調查員統一培訓后進行問卷調查，調查表依據職業健康體檢表結構進行制作。調查表內容包括個人信息、職業史、既往史以及家族史。吸煙定義為1支/d，且連續1年以上，飲酒為2次/周，連續半年以上。

主要儀器和試劑：HPLC裝置及色譜工作站、反相C18色譜柱A1260型熒光檢測器(Agilent Technologies公司，美國)；酶標儀(Synergy/HT，美國伯騰儀器有限公司)；MassARRAY Analyzer 4.0質譜儀(Agena， Inc)； 99.8%1-OHP 標 準品、99%咔唑標準品(Dr.Ehrenstorfer，GmbH德國)；人γ干擾素ELISA試劑盒、人尿肌酐ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)；全血DNA提取試劑盒。

方法：采用堿水解-高效液相色譜熒光法檢測尿1-羥基芘(1-OHPyr)水平[10]。用ELISA法檢測尿肌酐含量校正尿1-OHPyr數值。標準校準曲線具有良好的線性(r=0.999 1)。檢測限：尿樣加標確定儀器(3倍信噪比)檢測限0.01 ng/L。精密度為日間相對標準偏差2.31%～4.44%。準確度是尿樣加標回收率96%～110%。采用ELISA法檢測血清中IFN-γ的表達。嚴格按試劑盒說明書要求操作。采用DNA提取試劑盒抽提DNA后將樣本委托博淼生物科技(北京)有限公司采用飛行時間質譜進行DNA甲基化檢測。

統計學分析：全部數據資料采用EXCEL錄入，用SPSS 22.0進行統計學分析。檢驗水準α=0.05，連續性變量資料符合正態分布用t檢驗，方差分析；定性資料用χ2檢驗；使用協方差分析校正年齡、工齡、吸煙與飲酒；相關性分析采用多元線性回歸方法。

結 果

基本資料統計分析：暴露組和對照組間比較，吸煙史和飲酒史差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

各組尿1-羥基芘濃度與外周血IFN-γ的表達：暴露組與對照組間，尿1-OHPyr濃度差異有統計學意義(P＜0.05)，且暴露組1-OHPyr濃度高于對照組。爐側、爐頂兩工種尿1-OHPyr濃度與對照組差異有統計學意義(P＜0.05)。暴露組中焦爐工血清IFN-γ水平低于對照組(P＜0.05)，爐頂工明顯高于爐底工(P＜0.05)，3個工種與對照組差異有統計學意義，見表2。

IFN-γ啟動子區DNA甲基化分析：分析IFN-γ7個CpG位點，只有CpG-5有統計學意義，暴露組甲基化率高于對照組，見表3。IFN-γ基因質譜分析的屏幕截圖可見CPG-5顏色由深變淺，見圖1。

各變量間的相關性分析：采用多元線性回歸分析，IFN-γ為應變量，其余為自變量。IFN-γ CPG-5甲基化率與IFN-γ含量呈負相關，尿1-OHPyr與IFN-γCPG-5甲基化率呈正相關，差異有統計學意義(P＜0.05)。只有IFN-γCPG-5甲基化率進入方程差異有統計學意義，常數項69.497，β1=-82.438，見表4。

討 論

尿1-OHPyr是PAHs暴露的生物標志物[11，12]。本次研究暴露組尿1-OHPyr濃度顯著高于對照組，說明焦爐工工作場所PAHs暴露高于對照人群工作環境，其中爐側工、爐頂工PAHs暴露相對較高。建議有關部門做好煉焦工藝改善和焦爐工個體防護，重點防護爐側與爐頂的工人，并且定期進行職業健康體檢。PAHs是免疫抑制類物質，長期暴露引起免疫功能受損，IFN-γ是重要的抗腫瘤免疫細胞因子[13]。本次研究焦爐工外周血IFN-γ含量低于對照組，提示職業性PAHs暴露可降低IFN-γ表達。DNA甲基化是重要的表觀遺傳，越來越多的證據證明了腫瘤抑制基因的高甲基化和表觀遺傳沉默的存在[14]。研究表明，兒童暴露于空氣污染物中DNA甲基化發生了改變[15]。Tang研究將Jurkat T細胞和兩種肺癌細胞系暴露于不同濃度BaP，引起IFN-γ啟動子區甲基化與IFN-γ表達水平改變[16]。結合本研究結果，IFN-γCPG-5甲基化率暴露組高于對照組，而且IFN-γ與IFN-γ CPG-5甲基化率呈負相關，IFN-γCPG-5甲基化率與1-OHPyr正相關，證實了IFN-γ與IFN-γCPG-5同職業性PAHs暴露有關聯，為更深入研究職業性PAHs暴露引起細胞因子表觀遺傳改變提供依據。

表1 兩組一般情況比較()

表1 兩組一般情況比較()

變量 暴露組 對照組 t/χ2 P n %n%年齡(歲) 85 40.72±7.32 47 39.60±8.72 t∶0.787 0.433工齡(年) 85 19.46±8.12 47 19.26±8.94 t∶0.133 0.895吸煙 是 37 43.5 9 19.1 χ2=7.924 0.005否 48 56.5 38 80.9飲酒 是 33 38.8 8 17.0 χ2=6.718 0.010否 52 61.2 39 83.0

表2 尿1-OHPyr與外周血IFN-γ在暴露組中不同工種與對照組間相互比較()

表2 尿1-OHPyr與外周血IFN-γ在暴露組中不同工種與對照組間相互比較()

注：與對照組比較，?P＜0.05；與爐底比較，#P＜0.05。

組別 n 1-OHPyr(μmol/mol Cr) IFN-γ(ng/L)暴露組 85 4.47±2.37 41.01±20.40爐側 29 5.28±2.42? 48.42±17.16?爐頂 32 4.14±2.16? 45.23±23.41?#爐底 24 3.93±2.41 26.43±10.34?對照組 47 2.63±1.46 73.00±26.07 F? 12.446 46.379 P? 0.001 ＜0.001

表3 IFN-γ基因啟動子區各位點甲基化水平分析()

表3 IFN-γ基因啟動子區各位點甲基化水平分析()

CPG 暴露組(n=18) 對照組(n=15) P CPG-1 0.77±0.22 0.82±0.10 0.433 CPG-2 0.86±0.07 0.87±0.09 0.774 CPG-3 0.78±0.08 0.77±0.10 0.687 CPG-4 0.85±0.07 0.82±0.08 0.329 CPG-5 0.52±0.18 0.33±0.22 0.011 CPG-6 0.80±0.07 0.78±0.06 0.328 CPG-7 0.71±0.36 0.64±0.43 0.645平均甲基化率 0.76±0.21 0.72±0.26 0.191

圖1 IFN-γ基因質譜分析圖

表4 各變量間相關系數矩陣及檢驗結果