MiR?17?5p/BTG3 調節(jié)膠質瘤的作用機制

金世光 戴燕 李城 李昌熙 王大新

揚州大學臨床醫(yī)學院1醫(yī)學實驗研究中心，2疼痛科（江蘇揚州225001）

神經膠質瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)腫瘤，約占所有顱內原發(fā)腫瘤的40%～50%［1］，膠質瘤臨床治療的點難主要是由于其臨床表現(xiàn)和癥狀、影像學或形態(tài)學預警及其浸潤性沒有顯著的特征［2-3］。本課題組前期研究［4］發(fā)現(xiàn)，miR?17?5p 在膠質瘤中促進細胞增殖和侵襲。同時，利用生物信息學技術預測了miR?17?5p 靶基因BTG3（B?cell translocation gene 3），而BTG3 參與PI3K?AKT 信號通路。本研究目的旨在尋找miR?17?5p 作用的直接靶基因BTG3，而BTG3 參與PI3K?AKT 信號通路，從而闡明miR?17?5p 調節(jié)膠質瘤細胞增殖遷移的分子機制，并為尋找結膠質瘤的治療性靶標提供理論基礎與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 0.25%胰蛋白酶消化液，RNA 酶，10%胎牛血清H?DMEM 培養(yǎng)液，膠質瘤細胞系U87?2M1、SW1088，pmirGLO 載體，TBST 溶液。

1.2 儀器 qRT?PCR 儀（ABI StepOne Plus），生物安全柜1205A（FORMA），CO2培養(yǎng)箱（FORMA），倒置顯微鏡IX70（OLYMPUS），酶標儀（TECAN）。

1.3 實驗方法

1.3.1 利用生物信息學技術預測靶基因BTG3 TargetScan 程序，miRanda 程序和DIANA?microT 程序預測miR?17?5p 作用的直接靶基因，將三者中有兩個或兩個以上程序同時預測到的基因作為候選的靶基因，結合miR?17?5p 促進膠質瘤增殖遷移以及促進對化療抗性的生物學表型的特點，篩選出候選的靶基因BTG3。

1.3.2 細胞轉染 轉染前一天接種細胞于24孔板，0.5 mL 無抗生素培養(yǎng)基每孔，第2 天轉染時細胞達到60%～80%每孔。脂質體（lipofectamine 3000）轉染質粒與細胞中，混勻。孵箱37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.3 雙熒光素酶報告基因檢測 裂解細胞后，12 000 r/min 離心5 min，取上清。按照每個樣品需100 μL 的量，取適量Renilla 熒光素酶檢測緩沖液，按照1∶100 加入Renilla 熒光素酶檢測底物（×100）配制成Renilla 熒光素酶檢測工作液。每個樣品測定時，取樣品50 μL，加入100 μL 螢火蟲熒光素酶檢測試劑，以報告基因細胞裂解液為空白對照。Renilla 熒光素酶為內參的情況下，用螢火蟲熒光素酶測定得到的RLU 值除以Renilla 熒光素酶測定得到的RLU 值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。

1.3.4 qRT?PCR 驗證miR?17?5p 與BTG3 關系U87?2M1 細胞中分別轉染mimics control、miR?17?5p mimics、SW1088 細胞分別轉染ASO?NC、miR?17?5p ASO 后，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，利用qRT?PCR 檢測。

1.3.5 Western Blot 驗 證miR?17?5p 與BTG3 關系 細胞裂解后分別取20 μL 蛋白樣品上樣，進行SDS 變性10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠取出，轉膜1 h，封閉30 min，含一抗的TBST 溶液中過夜。漂洗5 min，共3 次，加入含二抗的TBST（Tris?Buffered Saline and Tween 20）溶液中室溫放置1 h。搖動漂洗5 min，共3 次，將膜置于超敏發(fā)光液中2 min，進行顯影、定影處理。

1.3.6 利用過表達和RNAi 的方法，檢測靶基因表達水平的變化對膠質瘤細胞增殖遷移的影響 將靶基因的過表達載體pcDNA3/target 轉染進入SW1088 和U87?2M1 細胞中，進行瞬時表達。以pcDNA3 作為陰性對照。而將針對靶基因的siRNA表達載體pSilencer/sh?target 轉染進入SW1088 和U87?2M1 細胞中，pSilencer/control 作為陰性對照。通過MTT 法和Transwell 侵襲實驗檢測細胞的增殖遷移能力。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件，統(tǒng)計學處理采用單因素方差分析進行檢驗。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 利用生物信息學技術預測靶基因BTG3 利用生物信息學技術預測miR?17?5p 的靶基因，結果miR?17?5p 與靶基因互補結合的具體位點見圖1。

圖1 生物信息學預測miR?17?5p 與靶基因BTG3 的結合位點Fig.1 Bioinformatics to test miR?17?5 p and target genes BTG3 binding sites

2.2 熒光素酶報告實驗驗證miR?17?5p 對候選靶基因BTG3 的直接調控作用 實驗結果表明，轉染pmirGLO，過表達miR?17?5p 以及封閉miR?17?5p，熒光值均沒有變化。轉染pmirGLO/BTG3?UTR，過表達miR?17?5p 后，熒光值降低；miR?17?5p被封閉后，熒光值上升（P＜0.05）。轉染pmirGLO/BTG3?mUTR，過表達miR?17?5p 以及封閉miR?17?5p，熒光值均沒有變化，見圖2。

圖2 熒光素酶報告實驗檢測miR?17?5p、BTG3 表達水平Fig.2 Luciferase detected expression of miR?17?5 p and BTG3

2.3 qRT?PCR 檢測miR?17?5p、BTG3 表達水平 實驗結果表明，U87?2M1 中細胞中過表達miR?17?5p 后，miR?17?5p 表達量升高、BTG3 表達量降低（P＜0.05）。SW1088 細胞中miR?17?5p 被封閉后miR?17?5p 表達量降低、BTG3 表達量升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 qRT?PCR 檢測miR?17?5p、BTG3 表達水平Fig.3 The mRNA levels were detected byqRT?PCR

2.4 Western Blot 驗證miR?17?5p 與BTG3 關系 實驗結果表明，過表達miR?17?5p 后，BTG3 蛋白含量降低。miR?17?5p 被封閉后，BTG3 蛋白含量升高（P＜0.05），見圖4。

2.5 靶基因BTG3 與膠質瘤細胞增殖之間的聯(lián)系 MTT 實驗檢測U87?2M1 細胞、SW1088 細胞各組細胞吸光值結果顯示，與母細胞相比，BTG3 沉默的細胞增殖速率加快，而過表達BTG3 的細胞增殖速率減慢，即BTG3 的表達量與U87?2M1 細胞的增殖速率呈負相關（P＜0.05），見圖5。

2.6 靶基因BTG3 與膠質瘤細胞侵襲之間的聯(lián)系 Transwell 侵襲實驗結果顯示，U87?2M1 細胞、SW1088 細胞中過表達BTG3 后穿過上室的細胞數(shù)量減少，即細胞侵襲速率減慢，而沉默BTG3 后細胞侵襲速率加快（P＜0.05），見圖6。

3 討論

圖4 Western Blot 檢測BTG3 蛋白含量Fig.4 Western Blot testedBTG3 protein level

圖5 MTT 實驗檢測細胞增值情況Fig.5 Cell proliferation detected by MTT

圖6 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力（×200）Fig.6 Transwell tested cell invasion（×200）

惡性膠質瘤呈浸潤性生長，無法根治，預后差，術后復發(fā)率高，易出現(xiàn)侵襲轉移、進展迅速、病死率高等特點［5-7］。惡性腫瘤患者中有15%～25%會發(fā)生腦轉移［8-9］。miRNAs 參與細胞的增殖、凋亡、細胞分化等多種生物學行為，同時也可參與惡性腫瘤的侵襲、遷移、腫瘤微環(huán)境的調節(jié)［10-14］。miR?17?5p 在肝癌、宮頸癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌等中的功能已經文獻報道［15-19］。

本研究在前期實驗中證實了miR?17?5p/BTG3在膠質瘤的增殖遷移中發(fā)揮著重要作用。為了深入了解miR?17?5p/BTG3 在膠質瘤細胞中的作用機制，通過生物信息學軟件（TargetScan，miRanda 和DIANA?microT）預測發(fā)現(xiàn)miR?17?5p 與蛋白BTG3的3′UTR 有結合位點。然后，通過熒光素酶報告實驗證實了miR?17?5p對BTG3具有靶定作用。而相關文獻報道BTG3 抑制PI3K?AKT 信號通路的激活，推斷miR?17?5p/BTG3 通過Akt 信號通路發(fā)揮作用，促進膠質瘤的惡性進展。為了驗證miR?17?5p/BTG3 在膠質瘤細胞中的作用機制，首先，通過qRT?PCR、Western Blot 驗證了miR?17?5p 對候選靶基因BTG3 的直接調控，且具有負調控作用。然后，通過MTT 法、Transwell 侵襲實驗檢測靶基因BTG3 對細胞增殖遷移的影響。實驗結果顯示靶基因BTG3 可介導miR?17?5p 對膠質瘤細胞增殖和侵襲具有調控作用。不足之處在于實驗結果主要以體外實驗進行，為了進一步證明miR?17?5p/BTG3 在膠質瘤細胞中的具體作用機制，下一步工作中在體內裸鼠實驗研究miR?17?5p/BTG3 對膠質瘤增殖遷移的影響。因此，本研究理解膠質瘤細胞增殖遷移的分子機制提供有意義的研究線索，并為尋找膠質瘤的治療性靶標提供理論基礎與實驗依據(jù)，這為今后惡性膠質瘤基因治療提供新的方向。