葡萄糖轉運蛋白1 在結直腸癌中的表達及其與預后的關系

武雪亮 王立坤 屈明 周海豐 郭飛 楊永江 劉博 楊東東 薛軍

河北北方學院附屬第一醫院1普通外科，2超聲醫學科，3病理科（河北張家口075000）

據報道20～40 歲的青年結直腸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者，其5年生存率分別為87.9%、75.4%、51.3%、8.0%，60歲以上老年患者的5年生存率則分別為91.9%、69.8%、52.8%、6.6%，因此早期診斷、合理治療和有效的預后監測是提高結直腸癌療效的關鍵［1-2］。但目前臨床常用的腫瘤標志物如CEA、CA199等的早期檢測并不令人滿意，因而，尋求一種特異性高、敏感性強的生物學指標勢在必行。

葡萄糖轉運蛋白-1（glucose transporter?1，GLUT?1）是葡萄糖轉運蛋白家族中的重要成員，廣泛分布于機體的細胞膜上，是介導葡萄糖攝取的主要轉運載體，其表達水平與機體細胞葡萄糖代謝水平密切相關。相關報道證實［3-5］，GLUT?1 在前列腺癌、胃癌、乳腺癌、頭頸癌、肺癌等多種癌癥中均有過表達。但目前，GLUT?1 在結直腸癌方面的研究較少，相關的致癌機制和通路尚不明確。本研究通過檢測GLUT?1 在結直腸癌中的表達情況，分析其與相關臨床病理因素間的關系，結合生存時間的隨訪，為結直腸癌的早期診斷、治療和預后監測提供準確、可靠的生物學指標。

1 資料與方法

1.1 病例資料 本次實驗對象為2012年2月至2014年2月間河北北方學院附屬第一醫院病理確診結直腸癌組織和癌旁正常組織標本各50 例，同時收集患者完整的臨床資料。

1.2 主要試劑與實驗方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人Glut?1（NBP1?35926）購于上海煊翎生物科技有限公司，羊抗鼠IgG?HRP二抗（SE134），購于北京索萊寶科技有限公司，DAB（P0202），上海碧云天生物公司，PBS 液（PH 7.2～7.4）購于廣州鼎國生物科技有限公司，構椽酸鹽緩沖液（PH 6.0）購于廣州鼎國生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購于長沙達爾鋒生物科技有限公司，SDS?PAGE 標準指示劑、RIPA 試劑購于上海基星生物科技有限公司、BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Life Technologies 公司。

1.2.2 RT?PCR 法檢測GLUT?1 mRNA 表達 提取并測定總RNA，設計GLUT?1 上游引物：5′?TCT?CTGGGTAAACAGGGATCAAACA?3′，下游引物：5′?TGAGGAGCAGGAAGGGTC?3′；GAPDH 上游引物：5′?GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG?3′，下游引物：5′?CCTGGAAGATGGTGATGGGATT?3′；反應體系：1×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，cDNA 模板2 μL，Taq 酶1.25 U，上下游引物各1 μL，RNA 酶抑制劑1 μL，反應總體積25 μL。根據試劑盒說明書操作進行擴增，產物經瓊脂電泳后以Labworks 4.5 圖像分析系統分析。

1.2.3 Western blot 法檢測GLUT?1 蛋白表達 提取正常腸粘膜、腺癌組織50 mg 蛋白，置入5×緩沖液（4∶1），100 ℃水浴，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，后轉至PVDF 膜，取出膜，加5%脫脂奶粉封閉，滴加特異性的一抗（GLUT?1 為1∶1 500，GAPDH 為1∶150）-4 ℃孵育過夜，滴加特異性二抗（1∶1 500），37 ℃孵育1h，再次加入TBST 洗滌液，熒光成像檢測定量分析，計算目的蛋白相對表達量。

1.2.4 免疫組織化學染色檢測GLUT?1 蛋白表達 制作結直腸腺癌和正常黏膜的石蠟包埋組織，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋并切片3～4 μm厚。石蠟切片放入3%H2O2，二甲苯（Ⅱ脫蠟各10 min，梯度酒精100%2 min，95%2 min，80%，2 min，70%2 min，蒸餾水洗2 次每次5 min（置于搖床）。3%H2O2中浸泡10 min，蒸餾水洗滌。高壓抗原修復90 s，室溫冷卻，PBS 洗滌切片。滴加5%BSA 封閉液，37 ℃孵育30 min，滴加GLUT1 一抗（1∶200），4 ℃過夜，37 ℃孵育生物素化的二抗30 min。蘇木素復染細胞核半分鐘，DAB 顯色，鹽酸乙醇脫水至透明、樹膠封片，光鏡下觀察。

1.2.5 結果判定［6］GLUT?1 陽性染色主要集中于細胞漿和細胞膜中，呈棕黃色或褐色顆粒，光鏡下每個樣本隨機取五個高倍視野（× 400）的陽性細胞數，取其均值作為GLUT?1 細胞數，其中≥1%的細胞著色定為陽性。

1.2.6 隨訪 通過門診復查、電話隨訪，時間為2018年10月30日。

1.3 統計學方法 應用SPSS 17.0 統計軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，計數資料以百分率表示，兩組比較運用χ2檢驗，多組比較應用方差分析，GLUT?1 陽性表達組和陰性表達組之間的生存差異應用Log?rank 檢驗計算，用GraphPad Prism 6 軟件繪制統計圖，設α=0.05 為檢驗水準。

2 結果

2.1 RT?PCR 檢測GLUT?1 的表達 以GLUT?1/GAPDH 比值作為RT?PCR 定量分析，癌組織中GLUT?1 mRNA 的表達水平（0.96 ± 0.05）明顯高于結直腸正常組織（0.17±0.02），有統計學差異，P=0.003，見圖1。

2.2 Western blot 檢測結直腸正常黏膜、腺癌組織中GLUT?1 蛋白的表達情況 以GLUT?1/GAPDH比值作為GLUT1 相對表達量，顯示與正常腸粘膜組織（0.17 ± 0.05）相比，腺癌（0.84 ± 0.06）組織中的表達明顯升高，上升趨勢明顯，差異有統計學意義，P＜0.05，見圖2。

圖1 RT?RCR 檢測GLUT?1 在結直腸正常黏膜、結直腸腺癌中的表達水平Fig.1 Expressions of GLUT?1mRNA in normal colorectal mucosa and colorectal adenocarcinoma were detected by RT?PCR

2.3 免疫組化檢測結直腸正常黏膜、腺癌組織中GLUT1蛋白的表達情況 結直腸癌組織中GLUT?1的陽性表達率為68.00%（34/50）明顯高于在正常組織中的表達16.00%（8/50），差異有統計學意義，P＜0.05，見圖3。

圖2 Western blot 檢測GLUT?1 蛋白在結直腸正常黏膜、結直腸腺癌中的表達水平Fig.2 Expressions of GLUT?1 protein in normal colorectal mucosa and colorectal adenocarcinoma were detected by Western blot

2.4 GLUT?1 表達與結直腸癌臨床病理特征的關系 GLUT?1 的表達均與腫瘤的浸潤深度、TNM 分期、淋巴結轉移、肝轉移及脈管浸潤相關（均P＜0.05）。TNM 分期高、分化越低、伴淋巴結轉移、肝轉移和脈管浸潤的患者GLUT?1 的表達均增強；GLUT?1 在CEA（+）、CA199（+）組織中的表達明顯高于CEA（-）、CA199（-）組，P＜0.05，而GLUT1 的陽性表達與患者腫瘤大小無相關性（均P＞0.05），見表1。

2.5 生存分析 將患者分為GLUT?1 陽性組和陰性組，通過對患者進行短期隨訪，記錄患者的生存時間，同時分別繪制生存曲線，GLUT?1 陽性組的中位生存時間為267 d（95%CI：230.07～303.93），最長生存時間為359 d；陰性組的中位生存時間為307 d（95%CI：279.16～335.82），最長生存時間為365 d，兩組間的生存曲線差異具有統計學意義，P=0.031，見圖4。

表1 結直腸癌組織中GLUT?1 的表達及與臨床病理參數的關系Tab.1 The relation of GLUT?1 expression and the clinicopathological parameters in the colorectal tissues

圖3 免疫組化檢測GLUT?1 在結直腸正常黏膜、結直腸腺癌中的表達（×400）Fig.3 Expressions of GLUT?1 protein in normal colorectal mucosa and colorectal adenocarcinoma were detected by IHC

圖4 生存曲線Fig.4 Suvival cure

3 討論

研究［7］認為，腫瘤的惡性生物學行徑必須依賴足夠的能量支撐，而葡萄糖的無氧糖酵解是其獲能的最主要途徑，這種獲能方式即使在高氧環境下亦能保證正常進行，因而這就要求必須要有足夠的葡萄糖供應。

GLUT?1 是葡萄糖轉運體家族中的重要成員，在真核生物和原核生物中均有發現，是所有膜傳輸研究最深入的蛋白質。GLUT?1 最初發現存在于紅細胞、血腦屏障、眼、胎盤、周圍神經和哺乳乳腺的內皮細胞中，通常在正常上皮細胞和良性上皮腫瘤中無法檢測到，但在人類多種惡性腫瘤中均發現GLUT?1 表達增加［8-10］。GLUT?1 在腫瘤發生、發展過程中，包括早期腫瘤生長，轉移和侵襲等方面均發揮重要作用。GLUT?1 介導腫瘤細胞內的基礎葡萄糖轉運，為腫瘤細胞能量代謝提供葡萄糖，其誘導血管生成是腫瘤發生、進展的標志，當癌細胞生長超過現有的血管支撐時，就會發生缺氧，因此，癌細胞通過激活負責葡萄糖運輸的基因，即GLUT?1 來對缺氧條件作出反應［11］。GLUT?1在惡性腫瘤中的調控機制涉及不同的信號分子和通路，包括PI3K/Akt 信號通路、缺氧誘導因子1（HIF?1）、Ras、c?Myc和抑癌蛋白p53。研究證實［12］，在胃癌、肝癌細胞內，HIF?1α能直接激活GLUT?l、胚胎丙酮酸激酶（PKM?2）、己糖激酶-1（HK?1）和2（HK?2）、乳酸脫氫酶A（LDH?A）等糖酵解相關因子的活性，加速糖酵解，促進能量攝取。周曉黎等［13］研究證實，GLUT?1 基因沉默通過阻斷PI3K/AKT 信號途徑，降低HIF?1α表達，誘導相關代謝酶下調，從而抑制腫瘤細胞的代謝和生長。此外，文獻中還報道GLUT?1 受胰島素樣生長因子-1、血小板源性生長因子、白介素-1 和TNF 等因子影響，共同調控腫瘤細胞的葡萄糖代謝［14］。

本研究從基因和蛋白兩方面均證實了在結直腸癌細胞中GLUT?1 mRNA 和蛋白水平明顯高于正常腸黏膜細胞，表明在腸粘膜癌變的過程中急需大量能量，而GLUT?1 水平的上調保證了腫瘤對能量的攝取。進一步研究顯示，GLUT?1表達水平與結直腸癌的分化程度、病理分期、浸潤深度、轉移均明顯相關，且與CEA、CA199 等腫瘤標記物亦相關，因而表明GLUT?1 表達的異常激活了腫瘤細胞的活性并促進其侵襲增殖，從而加速癌細胞的擴散和轉移。GABALLAH 等［15］通過定量實時聚合酶鏈反應檢測47 名結腸癌患者和20 名健康對照者的外周血標本中的GLUT1 表達，結果表明GLUT1在癌患者的表達遠高于健康者，且GLUT1 的表達與腫瘤分期（P=0.01）和轉移情況（P=0.009）顯著相關，與本研究結果一致。此外，WANG 等［16］研究表明在結直腸癌變及化療耐藥過程中，同樣證實GLUT?1 作為無氧糖酵解關鍵性因子發揮重要作用。本研究通過生存期的隨訪證實，GLUT?1的表達與結直腸癌患者生存期相關，陽性表達者生存時間明顯低于陰性表達者，因而GLUT?1 的表達水平可作為結直腸癌患者的重要的預后監測指標。楊通印等［17］研究證實聯合檢測GLUT?1、HIF?1α及LDH?5 在結直腸癌的表達，可作為評估結直腸癌的發展及預后的分子指標。YANG等［18］通過Meta分析亦證實GLUT?1 是結直腸癌患者侵襲性（P=0.03）和無疾病生存期（P=0.013）的重要生物學標志物，以上均與本研究成果一致。

綜上，GLUT?1 表達的異常升高參與了結直腸癌的發生和進展過程，且與預后相關，本研究所納入的樣本量尚小，今后要繼續擴大樣本量；此外，尚缺乏對其具體致癌機制和相應轉導通路方面的研究，這也將是本課題下一步的研究方向。