體外模擬胃腸消化中山楂多酚及抗氧化活性的變化

陳希苗，李美英，許秋莉，熊楚欣，孫遠明*

（華南農業大學食品學院，廣東省食品質量與安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）是我國傳統的藥食兩用資源，其味酸微澀，深受民眾喜愛。中醫記載其有行氣散瘀、消食導滯的功效，其藥用的歷史已有300多年[1]。現代研究表明，山楂具有降血脂、抗衰老、抗癌等多種藥理作用，其顯著的抗氧化能力被認為是發揮藥理學作用的重要基礎[2-4]。曾有學者測定了30 種水果的抗氧化活性，發現山楂抗氧化能力最強，其亞鐵離子還原能力為柑橘的7 倍[5]。

山楂的抗氧化活性與其含有的多酚類物質密不可分，相關分析結果表明，山楂鮮果總多酚含量與氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）存在正相關關系，相關系數r＝0.886[6]。目前，國內外學者從山楂中分離和鑒定出逾60 種多酚類物質，其中綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷、異槲皮苷等5 種含量較高，是山楂中主要多酚類化合物[7-8]。以往對山楂多酚的研究多關注其含量、構成及生理學活性，關于體內胃腸道環境對其多酚成分及抗氧化活性的影響鮮見報道。然而，多酚在體內各種消化道酶和酸堿環境的作用下其結構、含量及構成可能發生改變，影響其生理活性，不同食品中由于其多酚形態及種類存在差異，導致其在胃腸消化中的變化規律也不相一致，如Bouayed等[9]發現蘋果多酚經胃腸作用后，總多酚含量增加，抗氧化活性提高，而Pinacho等[10]的研究結果卻顯示胃消化對黑刺李多酚含量無顯著影響，腸消化后多酚中香豆素類化合物降解了90%以上。目前關于山楂多酚及其抗氧化活性在胃腸道環境下的變化還有待探究。

因此，本研究對山楂進行體外模擬胃腸消化處理，分析消化道環境對山楂總多酚、黃酮含量及抗氧化能力的影響，并利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定消化前后山楂中綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷和異槲皮苷5 種主要單體酚類化合物含量的變化，進一步探究胃腸消化中山楂多酚及抗氧化能力變化的物質基礎，以期為正確認知和評價山楂對人體的生理學活性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）品種為‘大金星’山楂，來源于山東臨朐縣偏口哥生態農業有限公司。

標準品綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷、異槲皮苷（純度＞98%）、沒食子酸、蘆丁、水溶性VE（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、Folin-Ciocalteu試劑、2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）、熒光素鈉鹽、胃蛋白酶（活力≥250 U/mg）、胰蛋白酶（8 U/mg）、豬膽粉上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Lab-1B-80真空冷凍干燥機 北京博醫康有限公司；LC-20AT HPLC儀 日本島津公司；MK-3酶標儀美國Thermo Labsystems公司；SRY-1230型恒溫水浴搖床、FJ-200高速分速均質機 上海標本模型廠；OSB-2000旋轉蒸發儀 埃朗科技國際貿易（上海）有限公司；LYNX4000臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；C18色譜柱 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山楂粉的制備

取新鮮山楂，洗凈、去核，切成1 cm左右厚度，放入-80 ℃冰箱冷凍后凍干，用粉碎機粉碎，過60 目篩，得到鮮山楂粉末，備用。

1.3.2 化學溶劑法提取多酚

1.3.2.1 山楂游離態多酚的提取

參照文獻[11]的方法，并稍作修改。準確稱取山楂粉2 g，加20 mL正己烷去脂，重復操作3 次。再加入預冷的體積分數80%丙酮溶液，在冰浴下14 000 r/min高速勻漿5 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，重復提取3 次后，合并上清液。45 ℃旋轉蒸干，用去離子水定容至20 mL，即得到山楂的游離態多酚，-20 ℃儲存備用。

1.3.2.2 山楂結合態多酚的提取

結合酚的提取采用堿水解法。向提取完游離態多酚的殘渣中加入40 mL 2 mol/L的NaOH溶液，充入氮氣，避光室溫下振蕩消化1 h。用12 mol/L HCl溶液調pH值至2.0，加入20 mL正己烷，去脂，重復2 次。加入40 mL乙酸乙酯，混勻，重復提取5 次，合并上清液，45 ℃旋轉蒸干，去離子水定容至20 mL，即得到山楂的結合態多酚，-20 ℃儲存備用。提取重復3 次。

1.3.3 體外模擬胃、腸消化

1.3.3.1 體外模擬胃消化

參照文獻[12]的方法并稍作修改。取3 g山楂粉，加入200 g生理鹽水，冰浴下14 000 r/min高速勻漿3 min，制成勻漿液，向勻漿液中補充生理鹽水203 g。模擬胃液組：20 g勻漿液水浴至37 ℃后，用1 mol/L HCl溶液調至pH 2.0，再加入4 mL模擬胃液（0.2 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L的HCl溶液）；胃酸對照組：20 g勻漿液加入4 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，調至pH 2.0；空白對照組：20 g勻漿液加入4 mL的生理鹽水。避光并充入氮氣，在37 ℃恒溫水浴搖床中消化2 h。分別于0、0.5、1.0、2.0 h時取樣，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，-80 ℃儲存備用。

1.3.3.2 體外模擬腸消化

向經過胃消化2 h后的樣品中加入1 mol/L NaHCO3調至pH 7.0，模擬腸液組：加入4 mL模擬腸液（0.2 g胰蛋白酶、1.25 g膽汁提取物溶于50 mL 0.1 mol/L的NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液）；空白對照組：等體積0.1 mol/L的NaHCO3-Na2CO3緩沖液代替腸液。

1.3.4 多酚、黃酮含量測定

多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[13]，以沒食子酸為標準品，多酚含量表示為100 g山楂中沒食子酸的質量。黃酮含量的測定采用硝酸鋁顯色法[14]，以蘆丁為標準品，黃酮含量表示為100 g山楂中蘆丁的質量。

1.3.5 ORAC測定

ORAC測定參照Prior等[15]的方法并加以改進。在96 孔板中加入20 μL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），再加待測山楂提取液或消化液20 μL，接著依次加入AAPH 140 μL（終濃度6 mmol/L）和磷酸鹽緩沖液20 μL，最后添加熒光素鈉溶液20 μL（終濃度63 nmol/L）啟動反應并迅速將酶標板置于熒光酶標儀（預置溫度37 ℃）中開始測定。采用動力學方式，每2 min測定一個點，至熒光強度衰減至零為止。另設兩個對照組：即沒有添加自由基熒光自然衰減對照（記為-AAPH）和沒有添加抗氧化劑作用自由基對照（記為+AAPH）。以Trolox為標準品，ORAC以1 g山楂中Trolox的物質的量表示。

1.3.6 HPLC法測定山楂多酚類物質消化前后含量的變化

1.3.6.1 HPLC條件

將1.3.3節中山楂模擬胃、腸消化液用0.22 μm濾膜過濾，進樣，分析山楂消化前后多酚類物質含量變化情況。HPLC梯度洗脫條件如表1所示。液相色譜柱：CNWSIL C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：流動相A為一級水（含體積分數0.1%甲酸）、流動相B為乙腈（含體積分數0.1%甲酸），紫外檢測波長：280 nm，流動相流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。

表 1 HPLC洗脫條件Table 1 HPLC elution conditions

1.3.6.2 標準溶液的配制

精確稱取0.5 mg的綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷、異槲皮苷標準品溶于1 mL甲醇中，配成混合標準儲備液，再用甲醇依次稀釋成不同質量濃度的標準系列溶液。

1.3.6.3 標準曲線的繪制

取1.3.6.2節中的標準系列溶液過0.22 μm的濾膜，按1.3.6.1節的色譜條件進行分析。以樣品質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，以峰面積外標法進行定量。線性關系如表2所示。

表 2 標準品測定的標準曲線回歸方程Table 2 Linear regression equations for fi ve phenolic standards

1.4 數據分析

采用SPSS 21.0軟件分析實驗數據，Origin 8.5軟件作圖，結果用±s表示。數據差異性采用單因素方差分析中的最小顯著差異法，P＜0.05表示差異具有顯著統計學意義。實驗均重復3 次。

2 結果與分析

2.1 山楂中多酚、黃酮含量及抗氧化能力

食品中的多酚根據其存在形態可分為游離態和結合態多酚，其中游離態多酚易溶于水或有機溶劑，而結合態多酚因與食品基質緊密結合，則需要通過酸、堿或酶水解才能釋放出來[16]。本研究采用體積分數80%的丙酮溶液，在冰浴高速勻漿條件下進行山楂游離態多酚的提取，剩余山楂殘渣經堿水解后再采用乙酸乙酯進行萃取得到山楂結合酚。

表 3 山楂中多酚、黃酮含量及ORACTable 3 Contents of polyphenols and fl avonoids and oxygen radical absorbance capacity of hawthorn

如表3所示，山楂中游離酚和結合酚的含量分別為（3 124.96±41.98）mg/100 g和（32.95±0.92）mg/100 g，游離黃酮和結合黃酮的含量分別為（1 760.56±79.03）mg/100 g和（25.16±0.33）mg/100 g，由此可看出，山楂中多酚的構成以游離酚、游離黃酮為主。研究發現，不同類

型食品中的多酚形態及含量存在顯著差異[17]，通常，小麥、玉米等糧谷類食品中的多酚主要以結合態的形式存在[11]，而在大多數水果中則游離酚含量顯著高于結合酚含量[18-19]，本研究山楂多酚的測定結果與以往水果多酚的研究結果一致。山楂多酚的ORAC測定結果顯示，樣品抗氧化能力與多酚含量成正比，其中游離酚的ORAC明顯高于結合酚ORAC，占總ORAC的93%，說明山楂游離酚是其抗氧化能力的主要貢獻者。

2.2 體外模擬胃消化過程中山楂多酚、黃酮及抗氧化活性的變化

圖 1 山楂模擬胃消化過程中多酚、黃酮含量及ORAC的變化Fig. 1 Changes in total polyphenol and fl avonoid contents and oxygen radical absorbance capacity of hawthorn during gastric digestion

如圖1所示，模擬胃液組、胃酸對照組和空白對照組之間的多酚、黃酮含量及ORAC無顯著性差異（P＞0.05），不同時間點之間也無顯著性變化（P＞0.05），說明胃蛋白酶和胃酸環境對山楂中多酚、黃酮的釋放或降解及抗氧化活性均無顯著性影響。這與黑刺李[10]、野櫻莓[20]多酚在胃消化過程中的變化規律一致，可能是由于黑刺李、野櫻莓與山楂同屬薔薇科，富含有機酸，其多酚類物質都以酚酸類（綠原酸、原兒茶酸、咖啡酸等）和原花青素類低聚、高聚物為主，這些多酚在以往研究中已被證實在酸性條件下性質較穩定，且pH值越低穩定性越好[21-22]；因此胃液中的強酸環境對山楂多酚影響較小，同時其抗氧化活性也無顯著性變化。

2.3 體外模擬腸消化過程中山楂多酚、黃酮及抗氧化活性的變化

圖 2 山楂模擬腸消化過程中多酚、黃酮含量及ORAC的變化Fig. 2 Changes in total polyphenol and fl avonoid contents and oxygen radical absorbance capacity of hawthorn during intestinal digestion

如圖2所示，在體外模擬腸消化中，模擬腸液組的多酚、黃酮含量及ORAC均顯著高于空白對照組（P＜0.05），推測這是因為腸液組中加入的胰酶和膽汁水解了多酚與細胞內外蛋白質結合形成的共價鍵、氫鍵等[23-24]，促進了山楂中多酚、黃酮等抗氧化活性物質的釋放。與0 h（腸）相比，模擬腸液組山楂多酚、黃酮含量在0.5 h內分別下降了16.26%和7.46%，空白對照組分別下降了32.58%和10.29%，0.5 h后趨于穩定（P＞0.05）。腸消化過程中多酚、黃酮含量顯著下降的原因可能是山楂多酚類化合物分子結構中多具有酚羥基，偏酸性，在堿性環境中不穩定，易發生降解生成其他物質[25]。其次，2.1節對山楂多酚形態的研究結果表明，山楂中以游離酚為主，在腸道堿性環境下山楂游離酚大量降解，其降解量大于多酚釋放量；因此腸道中山楂多酚、黃酮含量總體仍表現為下降。

腸道環境中，山楂抗氧化能力隨著多酚、黃酮含量的下降而降低，模擬腸液組和空白對照組的ORAC在0.5 h內分別從714.52 μmol/g下降到641.29 μmol/g和632.06 μmol/g，相應降低10.25%和11.54%；1 h時分別繼續下降到632.06 μmol/g和610.06 μmol/g，1 h后無顯著性變化（P＞0.05）。結合圖1、2可發現，在胃腸消化中山楂抗氧化活性與多酚、黃酮含量的變化規律相似，進一步說明多酚類化合物是山楂抗氧化能力的基礎。

2.4 體外模擬胃腸消化過程中山楂多酚類單體化合物的變化

為進一步探究和明確在胃腸道環境下山楂多酚中具體成分的變化，本研究結合文獻[1]的報道，選取了綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷、異槲皮苷等5 種山楂中含量較高的單體酚類化合物作為代表，研究其在胃腸道消化過程中的變化情況。圖3為混合標準品及胃、腸消化0.5 h的HPLC圖。

圖 3 混合標準品、胃腸消化0.5 h山楂樣品的HPLC圖Fig. 3 HPLC chromatograms of mixed standards and hawthorn subjected to 0.5 h of simulated gastrointestinal digestion

如表4所示，在模擬胃消化中，各單體酚類化合物含量在不同時間點無顯著性差異（P＞0.05），說明胃消化對山楂中單體酚無顯著影響。

表 4 胃消化后山楂中酚類單體含量變化Table 4 Changes in contents of individual polyphenols after gastric digestion mg/g

表 5 腸消化后山楂中酚類單體含量變化Table 5 Changes in contents of individual polyphenols after intestinal digestion mg/g

如表5所示，腸消化中山楂不同單體酚類化合物的含量變化規律不一致。金絲桃苷、異槲皮苷兩者的含量無顯著性變化（P＞0.05），但表兒茶素、原花青素B2和綠原酸含量則均發生顯著下降，其中表兒茶素降幅最大，在0.5 h內完全降解；原花青素B2次之，在0.5 h內降低了28.99%，1 h時已無法檢測到；綠原酸在0.5 h內下降了40.78%，1 h較0.5 h繼續降低22.95%，1 h后無顯著性變化（P＞0.05）。

由以上結果可知，金絲桃苷、異槲皮苷在胃腸消化中均較穩定，這可能是因為金絲桃苷和異槲皮苷互為同分異構體，在植物體內通常以糖苷鍵與糖基結合成苷類的形式存在，穩定性較強，在胃腸環境下不易分解[26]。

原花青素B2是表兒茶素的二聚體，但目前關于這兩者在胃腸消化中變化規律的研究結果卻各有不同。盛華剛等[27]發現金蕎麥多酚中原花青素B2和表兒茶素經胃消化后含量均明顯增加，而Kahle等[28]關于蘋果多酚的研究結果卻顯示原花青素B2在胃消化中含量下降，表兒茶素含量增加，這是原花青素B2在胃液中降解成表兒茶素所致。Kahle等[28]的研究同時還發現表兒茶素在腸液中會進一步異構化生成兒茶素，而在Bouayed[29]和Zhu Qinyan[30]等的研究中卻發現腸環境中，原花青素B2含量下降，表兒茶素和兒茶素含量卻沒有相應增加，據此他們認為原花青素B2在腸液中并未分解成表兒茶素，表兒茶素也未轉化成兒茶素，而是可能生成了其他化合物。各項研究結果不一致的原因可能與不同食品中多酚構成、性質存在差異有關；此外，多酚之間可能存在的相互作用也是導致胃腸道消化對其影響不同的原因之一。本研究中，原花青素B2和表兒茶素在胃消化后含量并未發現顯著變化（P＞0.05），在腸消化過程中含量卻均顯著降低（P＜0.05），說明腸道環境下，兩者發生了降解，但具體的降解途徑和降解產物還有待進一步確認。

綠原酸是由咖啡酸和奎寧酸縮合形成的酚酸，因此在偏酸性的胃環境中較穩定。但其分子結構中含有酯鍵和不飽和雙鍵等不穩定部分，易被堿水解或分子內酯基遷移異構化生成同分異構體新綠原酸和隱綠原酸[31]，故綠原酸在腸液中含量降低。

3 結 論

山楂中以游離酚為主，結合酚含量較低。山楂多酚在模擬胃消化中較穩定，其總多酚、黃酮含量及抗氧化活性均無顯著性變化，而在腸消化中，山楂多酚不穩定，發生降解，0.5 h時腸液組總多酚、黃酮含量均顯著降低，分別降低了16.26%和7.46%，抗氧化能力下降了10.25%，抗氧化能力下降與多酚含量降低成正比。進一步分析單體酚類化合物在胃腸消化中含量的變化規律發現，5 種單體酚在胃消化中含量均無顯著性變化，在腸消化中變化卻不相一致；其中金絲桃苷、異槲皮苷較穩定，含量無顯著性變化（P＞0.05），而表兒茶素在0.5 h內完全降解，原花青素B2、綠原酸在0.5 h內則分別下降了28.99%和40.78%。綜上，經胃腸道消化后，山楂總多酚含量下降，伴隨抗氧化能力顯著下降；不同多酚單體因其自身性質差異在胃腸道環境表現出不同的穩定性，其降解途徑、代謝產物及各多酚之間是否存在相互作用值得進一步探究。