微波輔助快速制備碳量子點及其對表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯的促氧化作用

吳春蓮，蒲洪彬，曲佳歡，孫大文，韋慶益*

（華南理工大學食品科學與工程學院，現代食品工程研究中心，廣東省冷鏈食品智能感知與過程控制工程技術研究中心，廣東 廣州 510006）

碳量子點（carbon quantum dots，CQDs）是一種粒徑小于10 nm、微觀近乎準球形、表面富含有機官能團、具有熒光性能的新型碳納米材料。由于CQDs具有環保、低成本、易制備和良好的生物相容性、光學穩定性等優點[1]，其在生物成像、生物傳感、催化、納米醫學、檢測等方面顯示了巨大的應用潛能。有研究表明，活性氧（reactive oxidative species，ROS）自由基特別是羥自由基（·OH）是很強的氧化劑，如果體系中產生·OH，CQDs表面的結構會發生改變，其熒光會被猝滅[2]。CQDs的合成方法分為top-down和bottom-up兩大類[1]。Top-down方法是指CQDs由較大的碳結構材料形成或剝離形成，包括電弧切割法、激光消融法、電化學法和氧化法等。Bottom-up方法是指由分子前驅物形成CQDs，主要包括煅燒或加熱法、微波合成法、載體合成法以及水熱合成法等。經過10多年的研究和發展，CQDs的合成技術趨向于成熟，材料的使用也越來越簡單和綠色。最近，利用微波輔助水熱合成法制備CQDs的研究層出不窮，但是這些研究中所使用的微波設備都是家用微波爐，存在著一定的安全隱患和制備條件不可控等缺點[3]。

表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是茶葉中兒茶素類化合物的主要成分，占綠茶中兒茶素總量的50%～75%[4]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗動脈硬化、抗菌、抗炎癥、預防癌癥、預防心腦血管疾病等多種生物活性[4-7]，深受醫學、營養學學科國內外研究者的廣泛關注。許多研究者認為EGCG分子含有多個酚羥基的特殊分子結構，具有良好的抗氧化活性，能夠清除自由基、減少活躍金屬離子的破壞作用、激活某些酶及相關的活性因子，在生物機體中具有重要的作用。但是，也有研究表明，EGCG不僅具有抗氧化作用，在一定的條件下還表現出促氧化活性，比如其在金屬離子（Cu2+、Fe3+）催化下易被轉化成反應活性較高的醌式中間體，體系中還伴隨著H2O2、·OH、超氧陰離子自由基（·）等ROS的產生[8-9]，這些ROS自由基對癌細胞具有很好的殺傷作用，同時還能夠對生物分子進行共價修飾，表現出一定的生物毒性[10-12]。但是細胞內的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等會對過量的自由基進行清理，使細胞中的自由基處于動態平衡狀態[13]。然而，不同的細胞類型所含有的過渡金屬離子濃度是不同的，已有研究報道惡性腫瘤細胞中的Cu2+濃度會高于正常細胞[14]。因此，很多研究者認為EGCG的抗腫瘤作用是通過促氧化作用機制產生的[9]。但在EGCG的促氧化作用過程中，EGCG和Cu2+的劑量-效應關系至今少有研究。

本研究通過高通量微波消解/萃取工作站制備CQDs，并以此為探針研究EGCG與Cu2+之間的促氧化作用及其劑量-效應關系，以期為EGCG的功能性應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EGCG（分析純） Sigma-Aldrich（上海）試劑有限公司；H2SO4、NaOH、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）（分析純） 廣州精科生物有限公司；二甲基亞礬（dimethyl sulfoxide，DMSO）（分析純） 阿拉?。ㄉ虾＃┰噭┯邢薰?；MD 31 mm透析袋（截留分子質量100～500 Da） 上海源葉生物科技有限公司；實驗用水為實驗室制備的超純水。

1.2 儀器與設備

JUPITER-B型高通量微波消解/萃取工作站 上海新儀微波化學科技有限公司；RF-6000型熒光分光光度計、UV-1800型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Tensor 27型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 德國Bruker公司；JEM-1400 Plus型透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM） 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 CQDs的制備和相對量子產率的測定

CQDs的制備參考文獻[15]的方法并稍作調整，采用微波輔助法。將2 g一水合檸檬酸和0.954 mL乙二胺充分溶解在20 mL超純水中，充分攪拌混勻后轉移到100 mL聚四氟乙烯反應釜中，在200 ℃、500 W下反應5 min。反應結束后自然冷卻至室溫。用0.22 μm微孔濾膜將反應液過濾，將濾液用截留分子質量100～500 Da的透析袋透析24 h后放置于棕色瓶中，于4 ℃冰箱中保存備用。

參照文獻[16]的方法測定CQDs的相對量子產率（quantum yields，QYs），測得所制備好的CQDs的相對量子產率為73.67%。具體方法如下：將硫酸奎寧溶解于配制好的0.1 mol/L硫酸溶液中，調節硫酸奎寧溶液和CQDs水溶液的濃度，使硫酸奎寧溶液和CQDs水溶液分別在360 nm和350 nm波長處的吸光度均小于0.1。配制該吸光度下的待測試樣，用熒光分光光度計分別測定該硫酸奎寧溶液和CQDs水溶液在360 nm和350 nm激發波長處的發射光譜，根據熒光光譜計算熒光峰面積，即積分熒光強度。硫酸奎寧在360 nm激發波長處的量子點產率為54%。根據公式（1）計算CQDs的相對量子產率。

式中：QYs和QYst分別表示CQDs和硫酸奎寧的相對量子產率/%；Is和Ist分別表示CQDs和硫酸奎寧的熒光積分面積；As和Ast分別表示CQDs和硫酸奎寧的吸光度；ηs表示CQDs溶劑（水）的折射率（1.33）；ηst表示硫酸奎寧溶劑（硫酸）的折射率（1.33）[16]。

1.3.2 CQDs的表征

利用Nanomeasure軟件測定CQDs的粒徑；采用UV-1800型紫外-可見分光光度計掃描CQDs的吸收光譜；采用RF-6000型熒光分光光度計測定CQDs的激發光譜和發射光譜，激發波長350 nm、發射波長440 nm、狹縫寬度3 nm；采用JEM-1400 Plus型TEM觀察CQDs的形貌和粒徑；采用Tensor 27型FTIR儀分析CQDs的表面基團：將適量冷凍干燥CQDs粉末加入到適量KBr粉末中，在瑪瑙研缽中充分碾磨，混合均勻后壓片制樣測定，掃描范圍4 000～500 cm-1。

1.3.3 CQDs的性質測定

1.3.3.1 pH值對CQDs發光性能的影響

不同pH值（pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11）的CQDs溶液均用0.1 mol/L H2SO4和0.1 mol/L NaOH溶液調節，并用pH計測定，室溫下用熒光分光光度計在350 nm激發波長處測其熒光強度，觀察其熒光強度的變化。

1.3.3.2 貯藏條件對CQDs發光性能的影響

將CQDs原液和稀釋105倍體積的CQDs溶液各分為3 份，每份5 mL，設置3 個平行，分別在-4 ℃冰箱內避光、常溫下避光、常溫下不避光的環境下放置不同時間（0、1、8、15、23、30 d）。測定時將CQDs原液稀釋105倍體積后，室溫下用熒光分光光度計在350 nm激發波長處測相應放置時間CQDs的熒光強度，稀釋后的CQDs溶液在室溫下直接測定，觀察其熒光強度的變化。

1.3.4 不同濃度的EGCG和Cu2+對CQDs熒光猝滅效果的測定

在4 mL塑料離心管中依次加入1 mL稀釋105倍體積的CQDs溶液、900 μL不同濃度的Cu2+溶液和100 μL 250 μmol/L EGCG溶液，使體系中Cu2+與EGCG的濃度比分別為1∶2、1∶1、2∶1、4∶1，用混勻器混合均勻后，在40 ℃水浴鍋中水浴30 min，用熒光分光光度計在350 nm激發波長處測其熒光強度。反應體系最終濃度為12.5 μmol/L EGCG和6.25、12.5、25、50 μmol/L Cu2+。根據公式（2）[17]計算CQDs熒光猝滅率（I）。

式中：Ia表示CQDs溶液中加入相應濃度Cu2+時的熒光強度；Ib表示CQDs溶液中加入相應濃度Cu2+和EGCG時的熒光強度。

在4 mL塑料離心管中依次加入1 mL稀釋105倍體積的CQDs溶液、100 μL 1 mmol/L Cu2+溶液和900 μL不同濃度的EGCG溶液，使反應體系最終濃度為50 μmol/L Cu2+和6.25、12.5、25、50 μmol/L EGCG。其他操作同上，根據公式（2）計算CQDs熒光猝滅率。式中：Ia為CQDs溶液中加入相應濃度EGCG溶液時的熒光強度；Ib為CQDs溶液中加入相應濃度EGCG和Cu2+溶液時的熒光強度。實驗平行測定3 次。

1.3.5 DMSO/EDTA-2Na對CQDs的熒光保護作用

在4 mL塑料離心管中依次加入1 mL稀釋105倍體積的CQDs溶液、400 μL超純水、200 μL 1 mmol/L Cu2+溶液、200 μL 14.08 mmol/L DMSO溶液（或2 mmol/L EDTA-2Na溶液）、200 μL 500 μmol/L EGCG溶液，用混勻器混合均勻后在40 ℃水浴鍋中水浴30 min，用熒光分光光度計在350 nm激發波長處掃描其發射光譜，實驗平行測定3 次。

1.4 數據分析

利用Origin和Omnic軟件對光譜圖進行分析及作圖；用Excel軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 CQDs的表征

圖 1 CQDs的紫外-可見吸收光譜、熒光發射光譜和激發光譜（a）、TEM圖（b）和FTIR圖（c）Fig. 1 Normalized UV-vis absorption, fl uorescence emission and excitation spectra (a), transmission electron microscopy image (b), and Fourier transform infrared spectroscopy spectra (c) of CQDs

本研究制備的CQDs具有安全、快捷等優點，且相對量子產率（73.67%）較高，與普通水熱法（80%）[18]基本持平；但是普通水熱法需要反應18 h，而通過微波消解工作站只需要反應5 min，一次性就可制備960 mL CQDs溶液。由圖1a的紫外-可見吸收光譜可以看出，所合成的CQDs溶液的吸收主要都在紫外光區，而在可見光區的吸收則比較弱，在波長238 nm附近出現了肩峰，348 nm波長處出現了寬的吸收峰。波長238 nm處的肩峰歸因于芳香C＝C鍵的π-π*躍遷，而在348 nm波長處寬的吸收峰歸因于C＝O鍵的n-π*躍遷[15,18]。由熒光光譜圖可以看出，該CQDs最佳激發波長和發射波長分別為350 nm和445 nm，手持紫外燈照射下發出藍色熒光。由圖1b可以看出，該CQDs類似球形，少部分呈不規則狀態，在水相中的分散性較好，但粒徑分布不太均勻，平均粒徑約為6 nm。為了探究該CQDs表面修飾的官能團，對其進行FTIR分析（圖1c）。在3 200～3 750 cm-1和2 900～3 050 cm-1處的峰可分別歸因于C—OH和C—H的伸縮振動；N—H的拉伸和彎曲振動分別出現在3 100～3 300 cm-1和1 552 cm-1處；1 656、1 150 cm-1處的峰分別表明存在C＝O和C—NH—C。由此可見，通過微波消解工作站制備得到的CQDs的結構和粒徑與文獻[15,18-19]基本一致。通過FTIR圖譜可以發現，CQDs表面含有羧基和氨基等含氮和含氧官能團，其表面被成功修飾了來源于乙二胺的氨基。這些官能團的存在大大增加了CQDs的水溶性[18]。

2.2 CQDs的性質

2.2.1 pH值對CQDs發光性能的影響

圖 2 pH值對CQDs熒光強度的影響Fig. 2 Effect of pH on the fl uorescence intensity of CQDs

CQDs的熒光強度具有pH值依賴性，微波輔助高通量制備的CQDs同樣具有這個特點。由圖2可以看出，CQDs在高pH值或低pH值溶液中熒光強度較低，但在pH 4～10的溶液中熒光強度基本保持恒定，不隨pH值的變化而變化。這與普通水熱法制備的CQDs基本一致[18]。這可能歸因于CQDs化學結構的變化或邊緣卡賓結構的三重態[18,20-21]，CQDs的表面狀態/分子狀態受溶液pH值的影響，太高或太低的pH值都會使CQDs表面的分子基團受到強烈的影響，大部分的CQDs沒有石墨晶格，導致熒光猝滅；在強酸性條件下，CQDs的卡賓結構鋸齒點被質子化，導致發光的三重態卡賓結構被破壞，發生熒光猝滅；而在中性或弱堿性情況下，CQDs的卡賓結構較穩定，熒光強度基本保持不變；但在強堿溶液中，CQDs表面的分子團會受到強烈的影響，表面結構被破壞，導致熒光猝滅。本實驗用超純水作溶劑，微量的EGCG和Cu2+不會對體系pH值產生明顯的影響。

2.2.2 貯藏條件對CQDs發光性能的影響

圖 3 CQDs原液（a）、稀釋液（b）貯藏過程中熒光強度變化趨勢Fig. 3 Effect of storage time on the fl uorescence intensity of stock (a)and diluted (b) CQDs

為研究CQDs的貯藏穩定性，利用CQDs在不同條件下貯藏1 個月后熒光強度的變化情況來探究CQDs的穩定性。由圖3可以看出，CQDs原液比較穩定，隨著貯藏時間的延長，-4 ℃避光、常溫不避光、常溫避光貯藏組的熒光強度都基本保持不變，說明CQDs原液貯藏1 個月中溫度和光照對其影響不大。但是稀釋后的CQDs穩定性則有所差異，不同的貯藏條件影響效果不同。-4 ℃避光和常溫避光貯藏1 個月，CQDs的熒光強度基本保持不變；而常溫不避光條件下貯藏則使CQDs熒光強度明顯下降，30 d后約下降了74%。出現這一現象的原因可能是CQDs原液稀釋了105倍體積，溶液中含有的CQDs較少，隨著貯藏時間的延長，稀釋后的CQDs受到光照的強烈影響發生團聚或衰減，導致熒光強度明顯下降。因此，制備好的CQDs最好在-4 ℃避光條件下以原液貯藏。

2.3 EGCG的促氧化作用

已有研究表明，EGCG在Cu2+等金屬離子作用下會選擇性地轉變成促氧化劑，體系中發生類似Fenton反應，產生·OH等ROS自由基[9,22-23]。另外有研究發現，體系中產生的ROS自由基能夠改變CQDs的表面狀態并導致熒光猝滅[15,24]。因此，本研究以CQDs為熒光探針，研究EGCG和Cu2+是否會猝滅CQDs熒光探針。由圖4可以看出，CQDs溶液中單獨加入100 μmol/L Cu2+或50 μmol/L EGCG，體系中CQDs的熒光強度變化不大；但在EGCG與Cu2+共同作用時，CQDs的熒光強度大幅下降，但沒有出現明顯的偏移現象。這可能歸因于EGCG和Cu2+之間的反應，Cu2+作為催化劑加速了EGCG自動氧化生成相應的半醌自由基和Cu+，半醌自由基被迅速氧化成相應的醌，而Cu+通過單電子轉移給O2氧化生成O2-·；同時，溶液體系中伴隨著H2O2的生成，Cu+與H2O2間發生類似Fenton反應，產生·OH，從而使CQDs熒光探針猝滅[15,22,25-26]。

圖 4 CQDs在Cu2＋及EGCG作用下的熒光猝滅作用Fig. 4 Fluorescence quenching of CQDs in the presence of Cu2+ and EGCG

圖 5 CQDs在Cu2＋、EGCG及DMSO（a）/EDTA（b）作用下的熒光強度Fig. 5 Fluorescence intensity of CQDs in the presence of Cu2＋, EGCG and DMSO (a)/EDTA (b)

為了進一步驗證EGCG是否在一定量的Cu2+存在下轉變成促氧化劑，產生·OH，從而猝滅CQDs熒光探針，選擇DMSO作為自由基清除劑、EDTA-2Na作為Cu2+的螯合劑[27]。如圖5所示，當體系中加入DMSO或EDTA時，CQDs熒光探針得到了一定的保護，加入1.408 mmol/L DMSO時，體系中熒光強度大約恢復了55%，這是由于DMSO不是很好的自由基清除劑[27]，所以不能完全清除EGCG和Cu2+所產生的自由基，因此CQDs熒光探針在一定程度上有所猝滅；但是當加入200 μmol/L EDTA時，CQDs熒光探針的熒光強度基本得到保護，少量的CQDs熒光探針猝滅，這是因為EDTA是很好的金屬螯合劑，使體系中游離的Cu2+減少，EGCG在沒有游離Cu2+存在的條件下促氧化作用受到抑制。由此說明，CQDs熒光探針的猝滅是由于EGCG在一定量的Cu2+存在下產生ROS自由基引起的。

圖 6 Cu2＋與EGCG濃度比對CQD熒光強度的影響Fig. 6 Effect of concentration ratio between Cu2+ and EGCG on the fl uorescence intensity of CQDs

為了進一步研究EGCG和Cu2+之間的劑量-效應關系，了解EGCG在Cu2+存在下的促氧化性質，研究EGCG和Cu2+濃度比對CQDs熒光探針猝滅的影響。由圖6a可以看出，固定EGCG濃度為12.5 μmol/L，不斷增加Cu2+濃度，當Cu2+和EGCG的濃度比為2∶1時，CQDs的熒光猝滅效果最明顯，繼續增加Cu2+的濃度，CQDs熒光探針的猝滅率無明顯的增加。當EGCG的濃度為50 μmol/L或者25 μmol/L時，隨著Cu2+濃度的不斷增加，同樣得到類似的結果。如圖6b所示，固定Cu2+濃度，隨著EGCG濃度的增加，體系中CQDs熒光探針猝滅效果先明顯升高后逐漸降低并趨于平緩。當Cu2+和EGCG的濃度比為2∶1，即EGCG濃度為25 μmol/L、Cu2+濃度為50 μmol/L或EGCG濃度為12.5 μmol/L、Cu2+濃度為25 μmol/L時，CQDs的熒光強度猝滅效果最明顯。繼續增加EGCG濃度，熒光猝滅效果降低。由此可以得出，Cu2+濃度是EGCG的2 倍時EGCG表現出更強的促氧化作用。

Hayakawa等[28]在1997年報道了茶多酚在Cu2+作用下對DNA和亞油酸的氧化作用，提出了自由基產生的反應式（式（3）～（6）），從反應式中可以看出1 個茶多酚與2 個分子的Cu2+作用，產生ROS自由基，但是在他們的實驗中所使用的Cu2+濃度和茶多酚濃度并沒有產生與本研究類似的劑量-效應關系。而本研究通過CQDs熒光探針可以清晰地看到Cu2+和EGCG濃度的劑量-效應關系，即EGCG在Cu2+存在的條件下表現出促氧化作用，而在Cu2+濃度是其2 倍的情況下表現出更強的促氧化作用，驗證了Hayakawa等[28]提出的兒茶酚在Cu2+作用下的自由基產生機制。

EGCG在Cu2+的作用下自動氧化生成Cu+和半醌自由基。Cu+和H+在O2的作用下反應生成H2O2。H2O2在金屬離子Cu+的作用下發生了類似的Fenton反應，產生·OH等ROS自由基[7,10]。ROS自由基會立即攻擊CQDs的表面官能團，使CQDs表面結構發生改變，從而使熒光猝滅[2]。一些抗氧化物質如其他茶多酚（表沒食子酸兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、兒茶素）[28]、白藜蘆醇[29]及其類似物，苯環上具有多羥基官能團結構的物質，當它們遇到一定量的Cu2+時也會產生促氧化作用，產生·OH等ROS自由基[30]。通過CQDs熒光探針可快速預知這些抗氧化物質在過渡金屬離子（如Cu2+等）存在下的促氧化性質。

3 結 論

本研究通過高通量微波消解/萃取工作站快速制備高相對量子產率的類似球形的水溶性熒光CQDs，研究了CQDs的pH值依賴性及其穩定性。另外，以此CQDs為熒光探針，研究了EGCG在Cu2+存在條件下產生的ROS自由基對CQDs熒光探針的猝滅作用，同時探討了EGCG和Cu2+的促氧化劑量-效應關系，即當Cu2+和EGCG的濃度比為2∶1時，體系中的熒光猝滅效果最明顯，EGCG的促氧化作用更強。本研究結果為CQDs的合成提供了新的方式，同時也為EGCG作為功能性物質的應用提供理論依據。