藤茶總黃酮提取物對糖尿病前期小鼠的干預(yù)作用

陳 選，陳 旭，汪少蕓*

（福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108）

糖尿病是一種由于胰島素分泌不足或外周組織對胰島素不敏感而導(dǎo)致的代謝性疾病，以持續(xù)的高血糖狀態(tài)為特征，并可能引起各種組織（如眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)等）的長期損害、功能不全或衰竭[1]。國際糖尿病聯(lián)盟公布的數(shù)據(jù)顯示：2017年全球的糖尿病成人患者（20～79 歲）已達(dá)到4.25億，其中我國的糖尿病患者數(shù)量高達(dá)1.14億，居全球第一位[2]。更為嚴(yán)峻的是，國家衛(wèi)生健康委員會的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明：我國有50.1%的成年人處于糖尿病前期，隨時都有發(fā)展成糖尿病的可能[3]。糖尿病前期是指介于糖尿病和正常血糖之間的一種狀態(tài)，糖調(diào)節(jié)機(jī)制受損[4]。生活方式干預(yù)、口服降糖藥及口服胰島素是治療糖尿病的基本步驟，其中控制飲食的生活干預(yù)方式是延緩或治愈糖尿病前期的重要手段[5]。

藤茶系葡萄科植物顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang）的莖葉，又名莓茶、甜茶藤、田婆茶、龍須茶、甘露茶等[6]。藤茶中的主要活性成分為以二氫楊梅素為主的黃酮類物質(zhì)[7]，該物質(zhì)可以通過提高線粒體功能，抑制左心室舒張末期和收縮末期直徑等來延緩或治愈糖尿病[8]。但是由于二氫楊梅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有6 個酚羥基，易被氧化，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，且具有較低的水溶性和脂溶性等，導(dǎo)致其成藥性差，生物利用度較低，不適用于藥效需求較高的糖尿病階段[9]，而更適用于對糖尿病前期的干預(yù)。在我國的貴州、云南、福建、廣東和湖南等地，居民有泡飲藤茶的傳統(tǒng)[10]。通過長期飲用藤茶的生活干預(yù)方式來預(yù)防、延緩或治愈糖尿病前期，進(jìn)而降低糖尿病的發(fā)病率存在可能性，目前對其研究較少。基于此，本研究擬對藤茶總黃酮提取物對糖尿病前期小鼠的干預(yù)效果及其機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)性探究，以期為降低我國糖尿病的發(fā)病率提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

4 周齡C57雄性小鼠，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2018-00013。基礎(chǔ)飼料、高糖高脂飼料 湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

藤茶總黃酮提取物（純度為88.76%） 張家界茅巖莓有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）美國Sigma公司；阿卡波糖片 德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒 南京建成生物科技有限公司；糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）檢測試劑盒 上海銘博生物科技有限公司；白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒 上海臻科生物科技有限公司；游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）質(zhì)量濃度測定試劑盒、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒 深圳市科潤達(dá)生物工程有限公司；C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）檢測試劑盒 杭州昊鑫生物科技股份有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2695型高效液相色譜儀（配有電噴霧離子源） 美國Waters公司；酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BS400全自動生化分析儀 邁瑞醫(yī)療國際有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藤茶總黃酮提取物的主要成分測定

參考張學(xué)娟[11]的檢測方法。

1.3.2 動物模型的建立及飼喂

參考孫文龍[12]的造模方法，并進(jìn)行了部分改進(jìn)：通過高糖高脂飲食結(jié)合注射STZ的方式建立前驅(qū)糖尿病模型。在溫度20～25 ℃，相對濕度45%～65%的飼養(yǎng)環(huán)境中，將70 只C57小鼠隨機(jī)分組裝籠，每籠10 只，籠中小鼠自由取水取食，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后將小鼠分2 組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中一組60 只小鼠，喂食高脂高糖飼料和蔗糖水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%），經(jīng)過3 周飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗后，注射60 mg/kg的STZ；另一組10 只小鼠，作為空白組（NC），始終喂食基礎(chǔ)飼料。

注射STZ后，將一組的60 只小鼠隨機(jī)分成6 組：即糖尿病模型組（MC）、黃酮提取物低劑量組（LF）、黃酮提取物高劑量組（HF）、阿卡波糖對照組（AC）和阿卡波糖-黃酮提取物聯(lián)用組（AF）。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考潘慧敏[6]的方法后確定劑量范圍，即分別向LF組每天灌胃200 mg/kg mb的黃酮提取物、HF組每天灌胃500 mg/kg mb的黃酮提取物、AC組每天灌胃10 mg/kg mb的阿卡波糖、AF組每天灌胃5 mg/kg mb的阿卡波糖和200 mg/kg mb的黃酮提取物，飼喂3 周。

1.3.3 空腹血糖的測定及口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)

對注射了STZ后第7、21天的小鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）：小鼠禁食不禁水16 h后，灌胃2 g/kg mb的葡萄糖溶液，然后分別在0、30、120 min時取小鼠尾靜脈血，利用血糖儀和血糖試紙測定血糖濃度。

1.3.4 生化指標(biāo)的測定

TG、LDL-C、TC、HDL-C、GSP、IL-4、FFA、TNF-α、CRP水平的測定均按照試劑盒的說明書操作及計(jì)算。

1.3.5 短鏈脂肪酸質(zhì)量濃度的測定

參考馬夢梅[13]的方法測定短鏈脂肪酸質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用ANOVA進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)，其中P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤茶總黃酮提取物的主要成分

經(jīng)檢測，藤茶總黃酮提取物中的主要成分為二氫楊梅素，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)（69.53±1.22）%，另外，二氫槲皮素、楊梅苷和楊梅素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（0.53±0.12）%、（0.87±0.12）%及（1.17±0.14）%。二氫楊梅素作為藤茶的主要功效成分，其在藤茶中的含量會受到品種、采摘部位及加工方式等因素的影響而產(chǎn)生差異[14]。

2.2 糖尿病前期小鼠模型的構(gòu)建

糖尿病前期模型小鼠的構(gòu)建是本研究順利進(jìn)行的關(guān)鍵，除了轉(zhuǎn)基因手段外，化學(xué)藥物誘導(dǎo)法是最為常見的造模方法。本研究在孫文龍[12]的方法基礎(chǔ)上結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對糖尿病前期模型小鼠的高糖高脂輔助STZ注射法進(jìn)行了部分修改：小鼠經(jīng)過3 周的高糖高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗后，被注射60 mg/kg的STZ。其中STZ是一種含亞硝基的化合物，進(jìn)入體內(nèi)后可通過多種機(jī)制特異性地破壞胰島β細(xì)胞。

圖 1 NC組與MC組小鼠的空腹血糖濃度變化（n＝10）Fig. 1 Blood glucose changes in mice from MC and NC groups (n = 10)

如圖1所示，NC組小鼠的空腹血糖濃度穩(wěn)定在4～6 mmol/L之間，而MC組小鼠的空腹血糖濃度隨著飼喂時間的延長而逐漸升高。根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5,15]，當(dāng)空腹血糖水平高于6.1 mmol/L，低于11.1 mmol/L時可初步診斷為糖尿病前期，因而本研究暫定選取0～21 d的非NC組小鼠為研究對象，進(jìn)行干預(yù)。

為進(jìn)一步確認(rèn)糖尿病前期小鼠的患病周期，本研究分別進(jìn)行了NC組與MC組小鼠在注射了STZ后第7、21天時的OGTT。由圖2A可知，第7天時MC組小鼠的OGTT在120 min時的血糖濃度高于7.8 mmol/L；由圖2B可知，第21天時MC組小鼠的OGTT在120 min時的血糖濃度未超過11.1 mmol/L；根據(jù)OGTT空腹血糖濃度小于7.8 mmol/L且餐后2 h血糖濃度在7.8～11.1 mmol/L之間的診斷原則[5,15]，可判定0～21 d的非NC組小鼠為糖尿病前期小鼠，即本研究的干預(yù)對象。

圖 2 NC組與MC組小鼠在第7天（A）和第21天（B）時的葡萄糖耐受性（n＝10）Fig. 2 Oral glucose tolerance test in mice from MC and NC groups on day 7 (A) and 21 (B) (n = 10)

2.3 藤茶總黃酮提取物對小鼠血糖濃度的影響

圖 3 小鼠的空腹血糖濃度變化（n＝ 8）Fig. 3 Blood glucose changes in mice (n = 8)

如圖3所示，第7天時各組小鼠間的空腹血糖不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第21天時，MC組的血糖濃度最高，且與LF組、HF組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，要高出HF組4.2 mmol/L，這說明藤茶中的總黃酮提取物可能與阿卡波糖相似，均具有降血糖的功效。同時AC組和AF組的空腹血糖濃度最低，且兩組間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說明在一定的劑量范圍內(nèi)，藤茶黃酮提取物和阿卡波糖聯(lián)用時的降血糖效果與阿卡波糖單獨(dú)使用的效果相當(dāng)，這在一定程度上可減輕阿卡波糖單獨(dú)使用時出現(xiàn)的腹脹、腹瀉等副作用[16]。

圖 4 小鼠在第21天時的OGTT結(jié)果（n＝ 8）Fig. 4 OGTT in mice on day 21 (n = 8)

如圖4所示，未經(jīng)任何干預(yù)的MC小鼠組即將發(fā)展成糖尿病小鼠，LF組的小鼠糖調(diào)節(jié)已嚴(yán)重受損，而HF組和AF組較接近于NC組，均處于較正常水平，這一情況與圖3中的小鼠空腹血糖濃度變化相吻合。

圖 5 小鼠在第21天時的GSP濃度（n＝8）Fig. 5 GSP contents in mice on day 21 (n = 8)

GSP可以反映體內(nèi)過去1～3 周的平均血糖水平[17-18]，如圖5所示，L F組的G S P濃度與M C組差異顯著（P＜0.05），HF組的GSP濃度較MC組低1.2 mmol/L（P＜0.01），AF組與AC、NC組間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由這一現(xiàn)象可推斷：藤茶中總黃酮提取物的降血糖功效具有一定的劑量效應(yīng)，即注射越高劑量的藤茶黃酮提取物則降血糖效果越顯著。

2.4 藤茶總黃酮提取物對小鼠胰島素的影響

圖 6 小鼠在第21天時的胰島素水平（n＝ 8）Fig. 6 Insulin levels in mice on day 21 (n = 8)

胰島素是一種葡萄糖依賴型激素，參與葡萄糖代謝，控制血糖平衡[19]。如圖6所示，LF組小鼠的胰島素水平和MC組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HF組小鼠的胰島素水平較MC組低3.1 μIU/mL，兩者間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HF組小鼠的胰島素水平和NC組間不存在差異。這可能是由于：MC組小鼠由于胰島β細(xì)胞受損，出現(xiàn)了胰島素抵抗癥[20]，而LF組、HF組經(jīng)過低、高劑量的藤茶黃酮提取物干預(yù)、調(diào)節(jié)后，受損的胰島β細(xì)胞的功能得到了修復(fù)，則胰島素的分泌水平出現(xiàn)了一定程度的降低[21]。

2.5 藤茶總黃酮提取物對小鼠炎癥因子與游離脂肪酸的影響

慢性亞臨床炎癥是胰島素抵抗綜合癥的一部分，慢性炎癥是發(fā)生糖尿病的危險(xiǎn)因素，通過抗炎提高胰島素敏感性對治療胰島素抵抗綜合癥是有益的[22]。IL-4、TNF-α和CRP是常見的炎癥因子，藤茶總黃酮提取物對各組小鼠血漿中炎癥因子的影響見表1。

表 1 藤茶總黃酮提取物對小鼠炎癥因子的影響（n＝6）Table 1 Effect of total fl avonoid extract from vine tea on in fl ammatory factors in mice (n= 6)

由表1可知，NC組的IL-4質(zhì)量濃度要顯著高于其他組，這可能是由于IL-4作為T細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，可以參與激活免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T細(xì)胞與B細(xì)胞的增殖和分化，但由于其他組小鼠在糖尿病前期的造模過程中T細(xì)胞已經(jīng)受損；因此，后續(xù)無論是藤茶黃酮提取物或是阿卡波糖均不能對受損的T細(xì)胞進(jìn)行很好地修復(fù)，導(dǎo)致IL-4分泌較少，這一結(jié)果與馬夢梅[13]的研究結(jié)果相反，可能是由于大小鼠間的體質(zhì)不同導(dǎo)致的；有研究已證實(shí)FFA可以通過抑制組織攝取和利用葡萄糖，降低組織對胰島素的敏感，血漿FFA水平升高則增加糖異生，促進(jìn)基礎(chǔ)狀態(tài)胰島素分泌并使肝清除胰島素能力下降，造成高胰島素血癥，從而引起胰島素抵抗[23-25]。本研究中LF組、HF組、AF組的FFA濃度介于NC組和MC組之間，且彼此間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說明FFA受個體的影響較大，不同身體情況的小鼠FFA濃度不同，但都表現(xiàn)出患糖尿病前期越嚴(yán)重則FFA濃度越高的趨勢；TNF-α可以減輕機(jī)體組織細(xì)胞對胰島素的敏感性[26]，本研究中AC組與AF組間的TNF-α質(zhì)量濃度不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能是因?yàn)樘俨柚械目傸S酮提取物可能與阿卡波糖具有相同的降血糖靶點(diǎn)，均是通過改變胰島素的敏感性來控制前驅(qū)糖尿病小鼠的血糖水平；CRP則是機(jī)體內(nèi)的一種促炎血漿蛋白，主要參與急性時相反應(yīng)[27]。本研究中HF組、AC組和AF組的CRP質(zhì)量濃度不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說明糖尿病前期小鼠經(jīng)過一段時間的藤茶總黃酮提取物及阿卡波糖的干預(yù)后，不僅小鼠的血糖水平得到了一定的控制，其炎癥也得到了一定的緩解。

2.6 藤茶總黃酮提取物對小鼠血漿脂質(zhì)的影響

流行病學(xué)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明：相較于體質(zhì)量正常者，肥胖者患前驅(qū)糖尿病的概率更高。這可能是由于肥胖者與正常者相比，有較低的葡萄糖氧化和升高的脂肪氧化水平[29-30]。TC、TG、LDL-C和HDL-C是衡量脂質(zhì)水平的重要指標(biāo)[31]。

表 2 藤茶總黃酮提取物對小鼠血漿脂質(zhì)的影響（n＝6）Table 2 Effect of total fl avonoid extract from vine tea on plasma lipids in mice (n= 6)

由表2可知，MC組的TC質(zhì)量濃度、TG濃度和LDL-C質(zhì)量濃度均要顯著高于NC組，而NC組的HDL-C質(zhì)量濃度則顯著高于MC組，由此可推斷出小鼠的糖尿病前期發(fā)病機(jī)理可能為：經(jīng)過高脂高糖飼喂后的小鼠首先出現(xiàn)了脂質(zhì)異常的肥胖癥，然后機(jī)體由于自身穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用，增多的脂肪組織趨向于代謝分解，從而導(dǎo)致糖脂代謝異常，導(dǎo)致了糖尿病前期的產(chǎn)生。經(jīng)過藤茶總黃酮提取物的干預(yù)后，機(jī)體的糖脂代謝得到了部分調(diào)節(jié)[32]，這也提示了藤茶的總黃酮提取物可能具有降脂減肥的功效。

2.7 藤茶總黃酮提取物對小鼠盲腸中短鏈脂肪酸濃度的影響

近年來，隨著對腸道菌群了解的深入，腸道菌群代謝活動對前驅(qū)糖尿病的調(diào)節(jié)作用逐漸成為研究的焦點(diǎn)，Larsen等[33]對糖尿病患者的糞便細(xì)菌16S rRNA進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)成年糖尿病患者腸道中的變形菌門數(shù)量明顯增加，梭菌綱的多樣性明顯減少。而碳水化合物是腸道菌群重要的能量來源，人體自身不能完全水解的復(fù)雜碳水化合物在腸道菌群的作用下，一部分生成小分子營養(yǎng)物質(zhì)，為宿主的生長繁殖提供能量[34]；另一部分則生成短鏈脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸和丁酸[35]。

表 3 藤茶總黃酮提取物對小鼠盲腸中短鏈脂肪酸質(zhì)量濃度的影響（n＝6）Table 3 Effect of total fl avonoids extract from vine tea on the concentrations of short-chain fatty acids in the cecum of mice (n= 6)

由表3可知，MC組的丙酸質(zhì)量濃度顯著高于其他組，NC組的丁酸質(zhì)量濃度與AF組不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，丙酸具有緩解低度炎癥、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和誘導(dǎo)內(nèi)分泌細(xì)胞釋放激素的能力，丁酸則具有調(diào)節(jié)血糖和脂質(zhì)代謝的重要功能[36]，這一結(jié)果提示腸道菌群很可能是藤茶黃酮提取物干預(yù)糖尿病前期藥理作用的紐帶。

3 結(jié) 論

在糖尿病前期采取有效措施進(jìn)行干預(yù)是延緩或治愈糖尿病的重要方式。在本實(shí)驗(yàn)中，高劑量組的藤茶黃酮提取物對糖尿病前期的小鼠顯示出干預(yù)作用，其有效地延緩或阻止了糖尿病前期小鼠進(jìn)一步發(fā)展成糖尿病。藤茶中的二氫楊梅素、二氫槲皮素、楊梅苷和楊梅素等物質(zhì)為藤茶的有效干預(yù)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，且黃酮類物質(zhì)具有多靶點(diǎn)的效應(yīng)，因而其可能是通過抗炎、調(diào)節(jié)糖脂異常及腸道菌群等路徑對糖尿病前期進(jìn)行了干預(yù)，本實(shí)驗(yàn)通過對相關(guān)指標(biāo)的測定，也反映了這一現(xiàn)象。下一步將從分子生物學(xué)的角度進(jìn)一步探討藤茶總黃酮提取物對糖尿病前期有效干預(yù)的具體信號通路，同時從食品加工的角度，以藤茶黃酮提取物為原料進(jìn)行綜合開發(fā)，豐富藤茶相關(guān)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)鏈。