乙酯型魚油對小鼠骨性關節炎的改善作用

王 凱，朱玉婕，李媛媛，戴宇峰，王玉明，王靜鳳*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節軟骨退變為主要病理特征的慢性退行性疾病[1]。迄今為止，世界范圍內有超過15億的OA患者，由此帶來的經濟損失每年高達1 900億 美元[2-3]。作為合成軟骨基質的單一細胞類型，軟骨細胞對于軟骨穩態的維持起著重要的作用[4]。最近有研究表明OA患者的關節軟骨中，軟骨細胞開始發生肥大向分化，出現軟骨內骨化進程進而引起細胞凋亡[5]。因此，維持軟骨細胞的正常狀態對于OA的治療至關重要。

自噬是細胞應對外部異常環境的一個重要的自我保護調節機制[6]。Caramés等報道在OA進程中軟骨細胞自噬進程發生紊亂，并且軟骨基質流失加重[7]。OA小鼠中軟骨細胞自噬機制的缺失也會導致軟骨細胞異常凋亡增加[8]。本實驗中的高純度魚油（fish oil，FO）富含乙酯型n-3系多不飽和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acid，n-3 PUFA）。近來有研究表明n-3 PUFA對于哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）（自噬負調節因子）有重要的調節作用[9]。Huang Minjun等報道Fat-1轉基因小鼠關節組織中mTOR的表達量下降，自噬進程被激活[10]。現階段關于魚油對OA的報道僅局限在改善疼痛和抗炎方面[11-12]，關于魚油對關節軟骨細胞自噬的調節還鮮有報道。本實驗采用手術方式建立內側半月板不穩（destabilization of the medial meniscus，DMM）小鼠OA模型，在動物體內探究了乙酯型魚油對骨性關節炎軟骨退變的影響，進一步研究了乙酯型魚油對軟骨細胞自噬的調節作用機制。本研究的主要意義在于為乙酯型魚油改善骨性關節炎軟骨退變進程提供新的理論依據，也為乙酯型魚油的進一步高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性C57BL/6J小鼠，體質量18～22 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司。動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。飼養室進行12 h光/12 h暗節律交替，保持通風良好，控制飼養溫度在（23±1）℃，飼養期間，小鼠自由飲食。

高純度乙酯型魚油購自威海博宇漁業有限公司。

UNIQ-10 RNA柱式提取試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司；M-MLV逆轉錄酶 美國Promega公司；TRIzol試劑及Maxima SYBR熒光染料 霍夫曼羅氏生物科技有限公司；蘇木精染料 藍季（上海）科學發展有限公司；醇溶性伊紅 上海試劑三廠；硫酸氨基葡萄糖 普愛生物工程（湖北）有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

iCycler iQ5系統Real-Time聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 美國Bio-Rad公司；GL-20M高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器公司；RM2135型石蠟切片機 德國徠卡公司；DP72型顯微鏡成像系統、BH-2型顯微鏡 日本OLYMPUS公司；HD-200p型加熱器及氮吹設備 瑞士Blue Marlin公司；6890A型氣相色譜儀 美國Agilent科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚油脂肪酸組成的測定

參照Ding Ning等[13]的方法，通過氣相色譜檢測脂肪酸組成：色譜柱采用HP-INNOWax石英毛細管柱（30 m×320 μm，0.25 μm），分流比20∶1，壓力62.47 kPa，流速1.19 mL/min；起始柱溫為170 ℃，后續按照3 ℃/min的速率升溫至210 ℃并保持15 min；檢測器采用火焰離子化檢測器，進樣口和檢測器溫度均為240 ℃，載氣為氮氣（1.2 mL/min）。含總脂肪酸99.15%（質量分數，下同）；其中，二十碳五烯酸49.29%、二十二碳六烯酸32.53%，二十碳五烯酸與二十二碳六烯酸質量比約為3∶2。

1.3.2 骨性關節炎模型建立及動物分組

9 周齡雄性C57BL/6J小鼠適應性喂養3 d后，手術方法構建小鼠DMM骨性關節炎模型[14]。手術8 周后，將假手術組（Sham）設為正常對照組，DMM手術組隨機分為模型對照組（DMM）、陽性對照組（GLU，195 mg/kg mb），魚油低劑量組（FO-L，100 mg/kg mb）和魚油高劑量組（FO-H，200 mg/kg mb），每組10 只。Sham組和DMM組灌胃生理鹽水，陽性對照組灌胃硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GLU）。每天灌胃1 次，灌胃周期為60 d。

末次灌胃后禁食不禁水12 h，摘眼球處死小鼠，迅速分離小鼠右后肢（每組3 只），剔除肌肉后截取關節部分（保留關節囊）用于組織學觀察和測定；迅速分離右后肢（每組7 只），剔除軟組織及關節囊后迅速剝離關節軟骨入液氮速凍，并保存于-80 ℃用于實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）分析。

1.3.3 組織學觀察與分析

截取右后肢關節部分立即置于體積分數10%中性甲醛固定液中，固定24 h，再將其放入10%乙二胺四乙酸二鈉（pH 7.3）中脫鈣3～4 周，每3 d更換脫鈣液，脫鈣后的關節組織于梯度乙醇溶液中脫水，常規石蠟包埋，行蘇木精-伊紅和甲苯胺藍染色，于顯微鏡下觀察軟骨結構變化。使用imageJ軟件對軟骨負重區的透明軟骨（hyaline cartilage，HC）、鈣化軟骨（calcified cartilage，CC）厚度及總軟骨厚度進行定量分析。使用OsteoMetrics分析軟件對軟骨面積進行定量。小鼠關節軟骨損傷組織學評估參考國際骨關節炎研究協會（Osteoarthritis Research Society International，OARSI）評分標準[15-16]。

1.3.4 qPCR分析

取出-80℃中保存的關節軟骨樣品，利用UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒提取其總RNA，取1 μg的總RNA，在M-MLV逆轉錄酶的催化作用下（反應條件及體系參照逆轉錄酶M-MLV的說明書）逆轉錄生成cDNA。qPCR體系（25 μL）為：cDNA 5 μL、上下游引物各0.75 μL、雙蒸水6 μL、SYBR 12.5 μL。反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸45 s，共45 個循環。以β-actin作為內參基因。各目的基因的引物序列如表1所示。

表 1 軟骨代謝相關基因引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR ampli fi cation of cartilage metabolism-related genes

1.4 數據統計分析

實驗數據利用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，并采用最小顯著性差異法進行兩兩比較，P＜0.05時為顯著差異，最終結果用 ±s表示。

2 結果與分析

2.1 乙酯型魚油能顯著改善骨性關節炎小鼠的軟骨結構，抑制軟骨退變進程

圖 1 骨性關節炎小鼠的關節軟骨結構組織形態學分析Fig. 1 Histomorphological analysis of articular cartilage in mice with osteoarthritis

由圖1A、E可知，相對于Sham組，DMM組軟骨結構破壞嚴重，蛋白多糖流失加重，提示關節炎小鼠出現明顯的軟骨退變現象。另外，OARSI評分顯著升高也進一步說明這一結果（圖1F）。FO干預后，透明軟骨厚度、HC/CC比例相對DMM組平均上升了125.73%和152.03%（P＜0.01）。鈣化軟骨厚度平均降低10.66%（P＜0.05）。軟骨面積和厚度分別增加了61.63%和31.88%，OARSI評分較DMM組平均降低42.19%（P＜0.01）。以上結果綜合說明FO能夠明顯改善OA小鼠的軟骨結構，抑制軟骨退變，維持軟骨基質成分的穩定。

2.2 乙酯型魚油能夠促進軟骨合成代謝關鍵基因的mRNA表達水平

圖 2 乙酯型魚油對軟骨合成代謝相關基因mRNA表達的影響Fig. 2 Effect of FO on relative mRNA expression of key anabolism-related genes

聚集蛋白多糖（aggrecan，Acan）和II型膠原是構成關節軟骨的主要成分[17]。如圖2所示，DMM組Acan和Col2α1的mRNA表達水平較Sham組極顯著降低（P＜0.01），說明在OA病理進程中軟骨基質的合成代謝受到抑制。給予FO干預后，Acan和Col2α1的表達水平明顯上升，并且有一定的劑量效應關系，FO-H組Acan和Col2α1 mRNA的表達量較DMM組分別極顯著升高197.24%和107.95%（P＜0.01）。以上結果提示FO能夠上調軟骨基質的主要成分Acan和Col2α1的mRNA表達水平，改善軟骨基質的合成代謝過程。

2.3 乙酯型魚油能夠抑制軟骨細胞成熟肥大相關基因的mRNA表達水平

圖1中DMM組鈣化軟骨區面積的增加，HC/CC比例降低，肥大軟骨細胞聚集且增多，提示正常軟骨細胞肥大態分化進程開始增加。Col10α1[18]、Runx2[19]是調控軟骨細胞肥大成熟的關鍵因子。

圖 3 乙酯型魚油對軟骨成熟肥大相關基因mRNA表達的影響Fig. 3 Effect of FO on relative mRNA expression of key cartilage hypertrophy-related genes

由圖3可知，相對于Sham組，DMM組Col10α1、Runx2的mRNA的表達水平極顯著升高（P＜0.01），進一步說明了OA進程中關節軟骨細胞出現明顯的成熟肥大向分化。經不同劑量的FO干預后，軟骨組織Col10α1和Runx2 mRNA的平均表達水平較DMM組分別降低27.52%和32.88%（P＜0.01），以上結果提示FO能夠顯著抑制OA進程中關節軟細胞的成熟肥大。

2.4 乙酯型魚油能夠調節軟骨細胞凋亡關鍵基因的mRNA表達水平

軟骨細胞成熟肥大分化會進一步引起細胞凋亡及軟骨基質的降解[20]。圖1的蘇木精-伊紅染色結果也顯示軟骨細胞凋亡后不能充滿陷窩而導致無細胞區空洞增多。Bax、Bcl-2和Caspase3是軟骨細胞重要的凋亡調節因子[21-22]。

如圖4所示，與Sham組相比，DMM組Bax和Caspase-3的mRNA表達量極顯著上升（P＜0.01），而抗凋亡因子Bcl-2的mRNA表達水平顯著下降，提示關節軟骨細胞凋亡進程被激活。FO干預后能明顯改善這一趨勢，FO-H組的Bax和Caspase-3 mRNA表達量較DMM組分別下降了27.11%和38.45%（P＜0.01），Bcl-2的表達量較DMM組升高了63.82%（P＜0.01）。以上結果共同說明FO能夠抑制軟骨中促凋亡關鍵基因的表達，促進抑凋亡關鍵基因表達，從而抑制OA病理中關節軟骨的異常凋亡進程。

圖 4 乙酯型魚油對軟骨細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響Fig. 4 Effect of FO on relative mRNA expression of key apoptosis-related genes

2.5 乙酯型魚油能夠促進軟骨細胞自噬相關基因的mRNA表達水平

自噬是軟骨細胞抵御外部異常環境變化時的正常自我保護調節機制[6]。mTOR是自噬進程的關鍵負調節因子[23]，LC-3B和ATG-5是調節自噬進程的關鍵基因[24]。

圖 5 乙酯型魚油對軟骨細胞自噬相關基因mRNA表達的影響Fig. 5 Effect of FO on relative mRNA expression of key autophagy-related genes

如圖5所示，DMM組的mTOR表達量較Sham組極顯著升高（P＜0.01），而LC-3B和ATG-5的表達量極顯著降低（P＜0.01），提示OA中mTOR出現異常高表達并抑制了軟骨細胞的自噬進程。不同劑量的FO均能改善這一情況，并有一定的劑量效應關系。FO-L組和FO-H組的mTOR mRNA表達量較DMM組平均下降了26.05%（P＜0.05），LC-3B和ATG-5的mRNA表達量分別升高了57.71%和50.34%（P＜0.01）。這表明FO能夠顯著下調OA進程中自噬抑制因子mTOR的表達水平從而激活軟骨細胞自噬進程，維持軟骨細胞的正常表型，從而抑制軟骨退變。

3 討 論

本實驗采用手術方法構建DMM小鼠OA模型，在動物實驗水平探究了FO對小鼠OA進程中軟骨退變的影響。結果表明，FO能夠顯著改善軟骨結構，維持軟骨基質成分的穩定。同時，FO能夠維持正常軟骨細胞狀態，抑制軟骨細胞的肥大分化和異常凋亡，機制探究表明FO能夠顯著上調自噬因子的表達。以上結果提示FO能激活軟骨細胞自噬來維持關節軟骨的穩態，抑制OA中的軟骨退變進程。

軟骨退變是骨性關節炎中一個重要的病理特征，主要表現為軟骨結構的損傷和基質成分的丟失[1]。作為合成軟骨基質的單一細胞類型，軟骨細胞對于軟骨穩態的維持起著重要的作用[4]。正常狀況下，軟骨細胞通過分泌II型膠原和蛋白多糖等軟骨基質成分來維持軟骨的完整性[14]。近來，Sampson等發現在骨性關節炎病理進程中，軟骨細胞發生成熟肥大向分化，合成X型膠原和Runx-2等因子，進而啟動軟骨內骨化進程[5]。本實驗中，DMM組鈣化軟骨區面積明顯增加，同時，關節軟骨中肥大調節因子Col10α1、Runx-2的mRNA表達水平明顯上升，提示OA病理進程中軟骨肥大化加劇，啟動了軟骨內骨化進程。與此相關，軟骨正常合成代謝調節因子Acan和Col2α1的表達也受到抑制。FO的干預能夠明顯抑制相關肥大因子的表達，抑制軟骨細胞的成熟向分化，結合Acan和Col2α1的表達情況共同說明FO能夠維持軟骨細胞的正常表型，從而抑制軟骨的退變。

軟骨細胞成熟肥大分化會進一步引起細胞凋亡及軟骨基質的降解[25]。Sakata等報道OA患者軟骨中細胞凋亡信號明顯增強，抑制軟骨細胞的非正常凋亡能夠減少軟骨基質成分的流失[26]。Lee等報道EPA能夠通過降低P53介導的凋亡關鍵基因Bax、Caspase-3的表達來抑制OA中的軟骨細胞異常凋亡進程[27]。Bcl-2是Bcl家族的重要成員，能夠結合Bax并抑制其活性表達，是重要的抗凋亡因子[28]。本實驗的結果顯示，FO的干預能夠顯著降低Bax、Caspase-3的mRNA表達，提高抗凋亡因子Bcl-2的表達，從而阻斷軟骨細胞的異常凋亡進程。

自噬是軟骨細胞應對外部異常環境變化的一個重要的自我保護調節機制[4]。Caramés等報道自噬是正常軟骨的重要保護機制，年齡引起的自噬機制缺失會引起軟骨細胞異常凋亡并引發OA[29]。mTOR是一種Ser/Thr蛋白激酶，眾多研究發現mTOR是重要的自噬負性調節子[22,30]。Huang Minjun等報道，Fat-1轉基因小鼠（n-6 PUFA轉化為n-3 PUFA）關節組織中mTOR的表達受到抑制[10]。本實驗采用的FO中富含乙酯型n-3 PUFA，其中EPA和DHA的含量分別為49.29%和32.53%。研究結果顯示FO干預后能顯著降低關節軟骨中mTOR的表達水平，同時能夠顯著提高自噬關鍵調節因子LC-3及ATG-5的表達水平。以上結果綜合表明FO通過降低mTOR的表達來激活關節軟骨中軟骨細胞自噬進程、維持細胞正常狀態，進而維持軟骨穩態。

綜上所述，FO能夠顯著改善DMM誘導的骨性關節炎小鼠中的軟骨結構，抑制軟骨退變，維持正常軟骨細胞狀態，其機制可能與激活軟骨細胞自噬來抑制其異常肥大、凋亡進程有關。