基于代謝組學研究苦蕎蛋白對高脂血癥小鼠的干預作用

周小理，張 歡，周一鳴*，劉泰驛，閆貝貝，肖 瀛

（上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418）

眾所周知，高脂飲食不僅會使血漿膽固醇水平升高，還會促進動脈粥樣硬化的生成，對人體心腦血管的健康有著極大的威脅。高脂血癥是包括血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平升高，高密度脂蛋白膽固醇水平降低的血脂代謝紊亂性疾病，是常見的代謝和內分泌疾病之一。高脂血癥與動脈粥樣硬化、糖尿病、非酒精性脂肪肝等疾病的發生、發展關系密切，是心腦血管疾病的主要危險因素之一。研究發現，多種植物蛋白如杏仁蛋白[1]、大豆蛋白[2]、燕麥蛋白[3]等，均具有降血脂功效。Shen Kuoping等[4]的研究表明膳食蛋白質攝入量與血清總膽固醇降低比例呈極顯著負相關（r＝-0.419，P＜0.01），植物蛋白的攝入量與血清總膽固醇下降比例呈極顯著正相關（r＝0.521，P＜0.01）。

苦蕎作為“藥食兼用”類綠色食品的典型代表，具有較高的營養價值和藥用價值，是亞洲和中東歐人們的傳統作物[5-6]。苦蕎籽粒中含蛋白16%～20%（質量分數，下同），苦蕎蛋白為結合蛋白，其中含有蛋白質65.8%、脂類22.0%、非纖維碳水化合物5.9%和3.1%的水分[7]。Javornik等[8]研究表明，苦蕎蛋白含清蛋白18%、球蛋白43%、谷蛋白38%，而醇溶蛋白僅占1%，正是由于醇溶蛋白含量極少，使得苦蕎蛋白安全性高，成為消費者可以信賴的食物。并且苦蕎蛋白所含氨基酸種類齊全且組成合理，8 種必需氨基酸含量豐富，尤其是精氨酸、賴氨酸、色氨酸、組氨酸含量較高；因此苦蕎蛋白的利用率（81.3%）比其他谷物（小麥（42%）、燕麥（57%））都高[9]。同時，苦蕎蛋白是苦蕎的主要生物活性成分，研究表明，不同苦蕎蛋白組分均具有不同程度的降血脂功能，其中清蛋白降血脂功能最強，其次為球蛋白，谷蛋白最弱[10]。同大豆分離蛋白和酪蛋白相比，苦蕎蛋白有顯著的降低肝膽固醇[11]、清除自由基[12]、抑制癌細胞增殖[13]等作用。

代謝組學是系統生物學的一個重要分支，以相對分子質量小于1 000的內源性代謝物為研究對象，通過考察生物體系受到刺激或干擾前后的內源性代謝物的變化來研究生物體系代謝途徑的一門科學[14-15]。目前，代謝組學在食品和營養科學領域的應用越來越廣泛[16-18]。尤其是在對以天然產物為基礎開發的功能性食品作用機制研究中起到了非常重要的作用[19]。代謝組學研究主要包括代謝物分析和數據分析兩部分，其中，代謝物分析所使用的技術主要包括核磁共振波譜、質譜、色譜和光譜分析技術等；數據分析主要分為兩類，即監督分析法和非監督分析法[20]。主要包括數據采集、原始數據前處理、以及借助生物信息學軟件對獲得的大量多維復雜數據進行降維處理并獲取相關信息，找出反映樣品內在機理及整體性差異的生物標志物。本實驗采用超高效液相色譜電噴霧電離串聯離子阱飛行時間質譜（ultra performance liquid chromatography-electron spray ionization tandemion trap-time-of-flight mass spectrometry，UPLC/ESI-ITTOF/MS）技術對高脂膳食小鼠的血漿樣品進行分析與測定，并通過偏最小二乘法判別分析（partial least squaresdiscriminate analysis，PLS-DA）模式結合代謝組網絡數據庫，尋找苦蕎蛋白飲食干預小鼠潛在的生物標志物及作用的代謝通路。從代謝組學角度探討高脂小鼠被干預的代謝通路，從而初步探究苦蕎蛋白發揮降血脂功效的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級C57BL/6小鼠，4 周齡，雄性，體質量14～16 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2007-0005。

苦蕎粉 山西雁門清高有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純） 美國賽默飛世爾公司。超純水由PURELAB Classic純水機制得。

1.2 儀器與設備

UPLC/ESI-IT-TOF/MS聯用儀（含兩個Nexera X2系列LC-30AD泵、Nexera X2系列SIL-30AC型自動進樣器、DGU-20A 5R在線脫氣機、CTO-20AC柱溫箱、CBM-20A系統控制器、SPD-M20A檢測器，LCMS solution Version 3.40工作站，Profiling solution數據處理軟件） 日本島津公司；FD-80冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；MDF-1156型超低溫（-152 ℃）冰箱 日本松下公司；PURELAB Classic純水機 英國ELGA公司；3-18K臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎蛋白粉制備

苦蕎粉經石油醚脫脂24 h后，自然風干。按苦蕎粉與蒸餾水質量比1∶10混合溶解，NaOH溶液調節pH值至8，磁力攪拌2 h，5 000 r/min離心20 min，取上清液。取得的上清液用HCl溶液調節pH值至4.5，離心，取其沉淀物冷凍干燥24 h，得到苦蕎蛋白粉（蛋白質量分數85%，水分質量分數10%，其他成分質量分數5%）。

1.3.2 UPLC/ESI-IT-TOF/MS條件

色譜柱為Shim-pack GIST C18（50 mm×3.0 mm，2.2 μm）。流動相A：0.1%（體積分數，下同）甲酸水溶液，流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液，流速0.4 mL/min，柱溫35 ℃，進樣體積5 μL。梯度洗脫條件見表1[20]。

表 1 UPLC/ESI-IT-TOF/MS流動相梯度Table 1 Mobile phase gradient program for UPLC/ESI-IT-TOF/MS

用正離子模式采集數據，霧化氣速率1.5 L/min，干燥氣壓強0.2 MPa，檢測電壓1.52 kV，界面電壓：正極4.5 kV、負極-3.5 kV，CDL及加熱部件溫度200 ℃，離子累積時間20 ms，質量掃描范圍m/z 100～1 000[4]。

1.3.3 實驗動物及模型的建立

以AIN-93G標準飼料預飼1 周，按體質量隨機分為3 組，每組9 只：對照組飼喂AIN-93G標準飼料；高脂組飼喂含有10%（質量分數，下同）脂肪、1%膽固醇和0.5%膽酸鈉的AIN-93G標準飼料；苦蕎蛋白組在高脂組飼料的基礎上用苦蕎蛋白粉替代酪蛋白，且苦蕎蛋白質量分數為20%。將小鼠同室且分籠飼養，進行自然光照，并自由飲食和飲水，環境溫度控制在（22±2）℃，相對濕度為40%～60%。

1.3.4 樣品的采集與預處理

飼養6 周后，小鼠在代謝籠中飼養12 h（在此期間小鼠禁食不禁水），稱體質量，用乙醚對小鼠進行麻醉，眼球取血，血液立即放入預先用肝素鈉處理的離心管內離心（4 ℃、4 000 r/min，15 min），取上清血漿，并保存在-150 ℃的冰箱中待測。

分析前將血漿樣品于37 ℃解凍，解凍后取血漿200 μL，加甲醇600 μL，漩渦振蕩30 s，13 000 r/min離心10 min，取上清液，N2吹干，殘渣用體積分數80%乙腈200 μL溶解，漩渦振蕩30 s，13 000 r/min離心10 min，取上清液進樣檢測[21]。

1.4 數據處理

UPLC/ESI-IT-TOF/MS采集的數據經過Profiling Solution軟件進行峰提取和峰匹配，所得數據集經過峰面積歸一化及80%規則處理后導入SIMCA-P 11.0軟件進行有監督的PLS-DA分析。相應的參數（R2Y、Q2等）用以考察模型的有效性，表示PLS-DA模型構建過程中所能解釋變量數據的比例，R2Y表示模型的解釋率，Q2表示模型的可預測度，它們的大小直接反映了該模型的可靠程度[22-23]。使用SPSS 16.0軟件進行統計學處理，3 組間采用t檢驗，檢驗標志性代謝物組間差異的顯著性。P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠血漿代謝指紋圖譜的建立

圖 1 UPLC/ESI-IT-TOF/MS采集的血漿樣品典型總離子流圖Fig. 1 Typical total ion current chromatogram for plasma obtained from UPLC/ESI-IT-TOF/MS

采用UPLC/ESI-IT-TOF/MS儀器在正離子模式下采集血漿樣品的代謝信息，圖1為正離子模式下血漿樣品的典型總離子流圖。從總離子流圖上可以直觀地觀察出LC圖譜上的差異，提示對照組、高脂組與苦蕎蛋白組小鼠在總體代謝上具有一定的差別。但是，這種直觀上的差異還有待于進一步的數據分析，以探尋3 組小鼠所表現差別的生物學基礎；因此，使用Profiling Solution軟件對所采集的3 組27 個血漿樣品的數據進行峰提取、峰匹配及歸一化等處理。

2.2 血漿代謝指紋圖譜的多變量數據分析及潛在生物標志物的鑒定

圖 2 基于UPLC/ESI-IT-TOF/MS分析的正離子模式下對照組、高脂膳食組和苦蕎蛋白膳食組血漿代謝物PLS-DA得分圖（A）和因子載荷圖（B）Fig. 2 PLS-DA analysis based on UPLC/ESI-IT-TOF/MS data of plasma samples in control, high-fat diet and TBP-treatedgroups under positive ion mode: PLS-DA score plot (A); PLS-DA loading plot (B)

由圖2A可以看出，3 組小鼠的血漿代謝產物之間存在差異。PLS-DA圖形顯示苦蕎蛋白組小鼠的空間分布較為分散，可能與苦蕎蛋白組小鼠的代謝之間存在較大的個體差異有關，同時說明代謝組學方法具有準確反映個體代謝特征的優點。高脂模型組的代謝物遠離對照組小鼠的血漿代謝產物，而苦蕎蛋白組小鼠的血漿代謝產物更接近于對照組，說明高脂組小鼠給予苦蕎蛋白后對高脂小鼠的異常代謝輪廓有的調節作用，使其更趨近于正常組。其中，正離子模式下，PLS-DA模型的R2Y和Q2分別為0.908和0.767，表明該模型是可靠的。

在圖2B中，每一個點代表一個變量，離原點最遠的代謝物是潛在的差異性物質，這些化合物可能是造成模型組和苦蕎蛋白組小鼠血漿代謝產物差異的主要成分。變量對分類的重要程度（variable importance in the projection，VIP）由其值的大小來衡量，并依據VIP值對變量進行篩選。VIP大于1且具有統計學意義（P＜0.05）的變量被認為對模型有顯著貢獻。因此將具有統計學意義（P＜0.05）和VIP大于1的代謝物定義為潛在生物標志物[24-25]。3 組間差異方向上，距離中心越遠的點對差異的貢獻度越大，越有可能是潛在的特征代謝物。

將潛在的生物標志物根據其質譜數據，在公共數據庫HMDB（http://www.hmdb.ca/）、METLIN（http://www.metlin.scipps.edu/）、KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）和SMPD（http://www.smpdb.ca/）中進行檢索和確認，并與文獻進行比較，共鑒定出12 個潛在的生物標志物（表2）。包括亞油酸、胞苷二磷酸（cytidine diphosphate，CDP）甘油、磷脂酰乙醇胺、半乳糖神經酰胺、腦苷脂、葡糖神經酰胺、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、葡糖苷酸、前列腺素G2、溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholines，LysoPCs）、鞘磷脂。其中前6 種代謝產物的含量在高脂組小鼠較對照組均顯著降低（P＜0.05），而PC、葡糖苷酸、前列腺素G2的含量與對照組相比均顯著升高（P＜0.05）。

圖 3 差異代謝物在3 組小鼠血漿中的含量水平Fig. 3 Levels of differential metabolites in mouse plasma in three groups

圖3為上述差異代謝物在3 組小鼠血漿中的含量比較。苦蕎蛋白對差異代謝物的調節情況，除了LysoPCs的含量仍與高脂組接近，其余11 種差異代謝物含量均趨向對照組小鼠的代謝水平變化。以上研究結果表明，高脂膳食引起的代謝紊亂由于苦蕎蛋白的干預得到了改善。

2.3 代謝通路分析

表 2 對區分對照組、高脂組、苦蕎蛋白組小鼠有顯著貢獻的差異代謝物Table 2 Differential plasma metabolites discriminating control,high-fat diet and TBP-treated mice

將表2中鑒定出的標志物輸入MetPA（http://metpa.metabolomics.ca./MetPA/faces/Home.jsp）數據庫中，構建分析代謝通路。代謝通路影響值的臨界值設置為0.1[26-27]，高于此值，將會被選擇作為潛在的靶標路徑。

圖 4 通過MetPA得到的通路分析概要圖Fig. 4 Summary of pathway analysis with MetPA

由圖4可知，由高脂膳食誘導的小鼠代謝紊亂主要與亞油酸代謝、甘油磷脂代謝、鞘脂類代謝、色氨酸代謝、花生四烯酸代謝、糖代謝6 條代謝通路相關。在苦蕎蛋白飲食干預組中，代謝通路的紊亂均得到改善，在代謝層面驗證了苦蕎蛋白對由高脂膳食誘導的代謝紊亂有較好的治療作用。

由表2和圖4可知，鑒定的12 個標志物中，PC和亞油酸主要參與亞油酸代謝；LPA、LysoPCs、CDP-甘油和磷脂酰乙醇胺主要參與甘油磷脂代謝；葡糖苷酸主要參與戊糖-葡萄糖醛酸酯轉化反應；鞘磷脂、半乳糖神經酰胺和腦苷脂主要參與鞘脂類代謝；葡糖神經酰胺主要參與色氨酸代謝；前列腺素和PC主要參與花生四烯酸代謝。其中，亞油酸代謝、甘油磷脂代謝通路影響值相對較高，分別為1和0.472 53；戊糖-葡萄糖醛酸酯相互轉化作用和鞘脂類代謝影響值次之，其值分別為0.2、0.195 49；色氨酸代謝和花生四烯酸代謝影響值分別為0.177 15、0.106 23。

亞油酸屬于多不飽和脂肪酸。脂肪酸不僅參與機體能量代謝及細胞膜、信號分子等合成，而且某些脂肪酸對于基因表達、細胞增殖和分化起重要作用，可作為脂類代謝異常的生物標志物[28]。如表2所示，苦蕎蛋白干預飲食后，亞油酸含量相對于對照組和高脂組有所升高，且苦蕎蛋白組亞油酸含量更接近對照組。這與亞油酸可降低小鼠體質量、血脂水平，升高血清脂蛋白脂酶、肝脂酶和總脂酶活性，發揮預防高脂血癥發生的作用的研究結果一致[29]。

血漿甘油的變化很可能是由于脂肪酶從富含甘油三酯的顆粒中釋放及甘油、甘油三酯、極低密度脂蛋白之間的相互作用引起的[30]。甘油磷脂除了構成生物膜外，還是膽汁和膜表面活性物質等的成分之一。甘油磷脂代謝紊亂與血脂異常等代謝性疾病、動脈粥樣硬化和糖尿病等多種疾病相關[31]。甘油磷脂的生物合成是由TagF聚合酶等催化合成的，而最近的研究發現，CDP-甘油作為一種受體來激活TagF聚合酶的活性，從而促進甘油磷脂的生物合成。由表2可知，苦蕎蛋白組CDP-甘油的含量相比高脂組顯著升高，因此，苦蕎蛋白可能通過激活TagF聚合酶的活性，從而發揮調節高脂血癥的作用。

PC能使血漿中膽固醇水平降低20%。研究表明，PC是很少能增加血漿高密度脂蛋白膽固醇的物質之一[32]。苦蕎蛋白干預飲食后，小鼠體內的PC較高脂膳食組小鼠含量降低。

LysoPCs包括LysoPC（14∶0）、LysoPC（15∶0）、LysoPC（18∶0）、LysoPC（18∶1）、LysoPC（17∶0）、LysoPC（20∶2）和LysoPC（20∶1）。LysoPCs是細胞膜與介導信號轉導的基本組成部分。LysoPCs水平可作為揭示病理生理學變化的臨床診斷指標。大量研究證明脂質代謝紊亂在高脂血癥的發生和發展中起著關鍵性的致病作用。LysoPCs在許多疾病，包括炎癥、動脈粥樣硬化、糖尿病，癌癥和血脂紊亂的進展中發揮重要作用，此研究中，與對照組相比，高脂飲食喂養的小鼠LysoPC（18∶0）水平顯著降低，這與Jin Shuna[33]和Li Sen[34]等的報道一致。在高脂飼料喂養小鼠的LysoPCs水平變化可能與高脂血癥的發病機制有關，可以作為潛在的生物標志物。有報道稱，血脂水平和LysoPCs之間復雜的相互作用[35]。因此，推測苦蕎蛋白對LysoPCs的作用可能有助于降低血脂水平，有待今后進一步研究證實。此外，LysoPCs是一個重要的活性分子，有多種生物學功能，可通過特異性受體介導單核細胞/巨噬細胞的信號傳導途徑[36-37]，因此它可能參與了高脂飲食誘導的炎癥反應。

PA和LPA是細胞內和細胞外信號轉導的重要磷脂信號分子。它們主要通過磷脂酶D和磷脂酶C兩條途徑產生，并且PA在磷脂酶A2的催化下可水解生成LPA。與高脂小鼠相比，苦蕎蛋白組小鼠體內的LPA含量有所下降（表2）。因此，推測苦蕎蛋白降血脂功效可能與磷脂酶D和磷脂酶C表達有關。

戊糖和葡萄糖醛酸轉換通路與扼合反應有關。葡萄糖醛酸扼合反應與機體內多種外源和內源性化合物的清除相關，并且在多種藥物及其氧化代謝產物、體內毒物、內源性激素、膽酸的代謝清除中發揮著重要作用。在本實驗中，苦蕎蛋白可能是通過對肝臟戊糖和葡萄糖醛酸轉換通路的調控，進而發揮相應的降脂作用。

鞘脂是組成真核細胞膜成分的一類脂質，對于維持細胞膜結構十分重要。鞘脂是眾所周知的具有生物活性的脂類，是作為細胞內外調節生理細胞信號傳遞過程的介質[38]。本實驗中，苦蕎蛋白對鞘磷脂的水平起到一定調節作用，使其含量更接近對照組（表2）。形成大量鞘脂的鞘脂代謝通路是一個復雜的反應網絡，并且以神經酰胺為代謝的中心。神經酰胺首先可以從絲氨酸和棕櫚酰輔酶A產生3-酮基二氫鞘氨醇，然后形成二氫（神經）鞘氨醇，二氫（神經）鞘氨醇被神經酰胺合酶酰化成二氫神經酰胺然后經過二氫脫氫酶催化，最后產生神經酰胺；其次，通過鞘磷脂是被鞘磷脂酶水解釋放磷酸膽堿和神經酰胺[39-40]。由此，推測苦蕎蛋白可能是通過影響神經酰胺的合成從而影響小鼠血脂水平。鞘脂的合成與控制細胞脂質動態平衡的轉錄因子和調節蛋白相關[41]。鞘脂類合成的代謝物如神經酰胺和鞘氨醇等影響膽固醇外排及調節血漿高密度脂蛋白濃度的機制。磷脂的降低導致細胞膜流動性下降，從而減少和影響細胞間和細胞外基質之間物質的交換[42]。膽堿是磷酰膽堿的重要前體，是組成和分泌極低密度脂蛋白的必要成分。因此，缺乏膽堿會導致肝臟中甘油三酯的積累，引起肝臟脂肪變性[43]。

前列腺素G2是一種炎癥介質，由表2可知，在苦蕎蛋白干預后，小鼠體內的前列腺素G2含量較高脂組有所下調。前列腺素可以通過環氧合酶產生花生四烯酸，花生四烯酸是最具有生物活性的n-6多不飽和脂肪酸。因此可以推測，苦蕎蛋白可以緩解由高脂膳食誘導的機體炎癥反應，并進一步改善花生四烯酸的代謝。

3 結 論

本實驗采用基于UPLC/ESI-IT-TOF/MS技術的代謝組學方法，并結合多元統計學研究了高脂膳食誘導小鼠在苦蕎蛋白干預下的血漿代謝變化，初步篩選出和高脂血癥相關的12 種潛在的生物標志物及其參與的6 條代謝通路，進而初步揭示了喂食苦蕎蛋白后對高脂小鼠代謝紊亂干預的作用機制。結果表明，高脂膳食誘導小鼠血漿代謝譜發生了顯著性變化，苦蕎蛋白可通過升高小鼠血漿中亞油酸含量抑制高脂膳食誘導小鼠體內的亞油酸代謝，降低LPA、LysoPCs含量，升高CDP-甘油和磷脂酰乙醇胺含量，使得甘油磷脂代謝得到明顯改善，通過調節鞘磷脂、半乳糖神經酰胺和腦苷脂含量從而調節鞘脂類代謝，并且苦蕎蛋白可能調控戊糖和葡萄糖醛酸轉換通路、緩解由高脂膳食誘導的機體炎癥反應，進而預防或抑制高脂血癥的形成。