灰樹花液體培養特性及胞外酶活性研究

李文德 張文斌* 華 軍 王治江

（1甘肅省張掖市經濟作物推廣站，甘肅張掖7340001；2河西學院農業與生物技術學院，甘肅張掖734000）

灰樹花（Grifola frondosa）又名栗子菇，蓮花菌，舞茸等。隸屬擔子菌門，（Basidiomycota）傘菌亞門，（Agaricomycotina）傘菌綱，（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）薄孔菌科（Meripilaceae）樹花菌屬（Grifola），是一種食藥兩用的珍稀食用菌，具有極高的營養價值和藥用價值，此外還具有抗輻射功效[1-2]。香港大學張樹庭教授對其評價是“無葉無芽無花自身結果，可食可補可藥周身是寶”。據浙江醫科大學的黃幸紓教授等人的研究及臨床試驗證實，從灰樹花的子實體、菌絲體及發酵濾液中提取的活性多糖均具有顯著地抗癌及免疫調節作用[3]。目前國內已展開了灰樹花栽培技術、生態特性與營養分析等多方面的研究[4-7]，但有關灰樹花液體培養條件和胞外酶活性的研究卻報道不多。筆者研究了灰樹花在不同培養條件下的生長特性及4種胞外酶的活性變化，對加速灰樹花的制種速度，提高灰樹花產量，促進農業、食品、醫藥工業的發展都具有一定的現實意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

灰樹花2號，購自北京吉蕈園科技有限公司。供試碳源為可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇，均為分析純。供試氮源為蛋白胨、酵母膏、硝酸鉀、硝酸銨、尿素，均為分析純。麩皮購于張掖市市場。礦質元素為硫酸銅、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、硫酸錳、硫酸鎂、硫酸鋅，均為分析純。

1.2 供試培養基

母種培養基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，瓊脂20 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，加水1000 mL。液體種培養基為不加瓊脂的母種培養基。碳源基礎培養基為母種培養基中葡萄糖用供試碳源代替。氮源基礎培養基為母種培養基中蛋白胨用供試氮源代替。礦質元素基礎培養基為母種培養基中磷酸二氫鉀、硫酸鎂用供試礦質元素代替。初始pH基礎培養基為母種培養基，用10%的鹽酸和10%氫氧化鈉調至所需pH。

1.3 試驗方法

1.3.1 液體菌種培養

將配制好的液體培養基分裝于三個250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，121℃下滅菌30 min，冷卻后接入已經活化的斜面母種（0.5 cm×0.5 cm）5片，在25℃、110 r/min恒溫振蕩培養7 d。

1.3.2 不同碳源對灰樹花菌絲生長的影響

稱取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖、可溶性淀粉各20 g，分別加入1000 mL供試碳源基礎培養基中，每一碳源處理培養液分裝于三個250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，經滅菌后接入5%的液體菌種，在25℃、110 r/min恒溫振蕩培養。7 d之后測定菌絲生物量。

1.3.3 不同氮源對灰樹花菌絲生長的影響

稱取蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸銨、硝酸鉀、麩皮各4 g，分別溶于1000 mL供試氮源基礎培養基中，每一種氮源處理培養液分裝于三個250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，接種、培養與測定同1.3.2。

1.3.4 不同礦質元素對灰樹花菌絲生長的影響

稱取硫酸錳、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸亞鐵、硫酸銅、磷酸二氫鉀各0.5 g，分別溶于1000 mL礦質元素基礎培養基中，分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，接種、培養與測定同1.3.2。

1.3.5 初始pH對灰樹花菌絲生長的影響

用10%的氫氧化鈉和10%的鹽酸及酸度計調基礎培養基初始pH分別為2、4、6、8、10、12后分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL。每一處理三個重復，接種、培養與測定同1.3.2。

1.3.6 酶活性測定

粗酶液的制備：在250 mL的三角瓶中加入100 mL液體培養基并在每瓶中接入2%的液體菌種，在25℃、110 r/min條件下恒溫振蕩培養7 d。培養結束后將菌液用四層紗布過濾，取濾液于10 mL離心管中，在5℃、4000 r/min條件下離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

淀粉酶活力的測定參照朱啟忠的方法［8］，羧甲基纖維素酶活力測定、鄰苯二酚氧化酶活性的測定參照馬桂珍的方法［9］，愈創木酚氧化酶活性的測定參照吳進菊的方法［10］。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對灰樹花菌絲生長的影響

由表1可知，不同碳源對灰樹花菌絲生長均有影響，六種碳源培養基中葡萄糖為碳源的菌絲生長速度最快，菌絲干重為1.647 g/L，與乳糖、麥芽糖、甘露糖為碳源沒有差異，但與可溶性淀粉、蔗糖為碳源時差異達到顯著水平。蔗糖為碳源的培養基中菌絲生長速度最慢，菌絲干重僅0.941 g/L，與葡萄糖為碳源的培養基差異顯著，與其他碳源培養基沒有差異。

表1 不同碳源對灰樹花菌絲生長的影響

2.2 不同氮源對灰樹花菌絲生長的影響

由表2可知，不同氮源對灰樹花生長速度均有影響，在硝酸銨作為氮源的培養基中菌絲生長速度最快，菌絲干重為7.877 g/L，與其他氮源差異均達到顯著水平。在尿素為氮源的培養基中菌絲生長速度最慢，菌絲干重為1.064 g/L，與硝酸銨為氮源的培養基差異達到極顯著水平，與其他氮源培養基沒有差異。

表2 不同氮源對灰樹花菌絲生長的影響

2.3 不同礦質元素對灰樹花菌絲生長的影響

由表3可知，不同礦質元素對灰樹花生長均有影響。六種不同的礦質元素培養基中，以磷酸二氫鉀培養基中菌絲生長速度最快，菌絲干重為0.672 g/L，與硫酸亞鐵培養基差異達到顯著水平，與硫酸錳培養基、硫酸銅培養基、硫酸鋅培養基、硫酸鎂培養基達到了極顯著差異水平。六種礦質元素培養基中硫酸鎂培養基菌絲生長最慢的，菌絲干重為0.421 g/L，與磷酸二氫鉀培養基、硫酸亞鐵培養基達到極顯著水平，與硫酸錳培養基達到顯著水平，與其他兩種沒有差異。

表3 不同礦質元素對灰樹花菌絲生長的影響

2.4 不同初始pH對灰樹花菌絲生長的影響

圖1 不同初始pH對灰樹花菌絲生長的影響

圖2 鄰苯二酚氧化酶、愈創木酚氧化酶活性

由圖1可知，灰樹花在不同初始pH的培養基中，其生長量不同。pH2、4時菌絲生物量最大，初始pH達4后菌絲生物量急劇降低，在pH大于6以后菌絲生物量變化不明顯，pH變化對其生長影響不大。

2.5 灰樹花菌絲胞外酶活性測定

圖2、圖3結果表明，在整個發酵培養期間，淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創木酚氧化酶均有活性，且其酶活性高峰交替出現。其中鄰苯二酚氧化酶、愈創木酚氧化酶酶活性相似，均在46 h時出現第一次高峰，之后活性逐漸降低，但愈創木酚氧化酶在165 h后又小幅度上升，但二者總體呈下降趨勢。羧甲基纖維素酶也在46 h時出現第一次酶活性高峰，之后逐漸降低，在97 h時酶活性降到最低，之后隨培養時間的增長酶活性又逐漸上升，且在整個培養期羧甲基纖維素酶活性最高。淀粉酶的活性高峰則出現在培養后期，在整個發酵培養過程中其活性波動較大，雖然在前期會出現一個小的高峰（46 h），但之后仍呈下降趨勢，到97 h達到最低點，之后酶活性迅速上升，在117 h達到第二次高峰，但之后又緩慢下降，在143 h后又上升，但總體呈增強趨勢。在整個發酵培養過程中，灰樹花雖然在早期就開始利用培養液中的糖類物質、木屑纖維素及淀粉類物質，而淀粉類物質在后期利用更多。

3 小結與討論

不同碳源對灰樹花菌絲生長均有影響，最適碳源為葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖，灰樹花菌絲生長較好，菌絲干重較大；但從經濟角度看，葡萄糖為其最適碳源；這一結果與前人研究相似[11]。所用灰樹花菌株的最佳氮源是硝酸銨，這一點與陳石良等人對灰樹花的研究結果不一致，其主要原因可能是灰樹花菌株之間存在差異[12]。試驗表明灰樹花菌絲生長的最佳礦質元素是磷酸二氫鉀，這與張松等人的研究結果相同[13]。灰樹花菌絲生長的最適初始pH 2～4，由于沒有設計pH 0～2，其結果還有待進一步研究。

圖3 淀粉酶、羧甲基纖維素酶活性

灰樹花在液體發酵培養時，淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創木酚氧化酶這4種酶均有活性，表明灰樹花具有降解多糖類物質和纖維素、木質素的能力，這與倪新江等人的結論一致[14]。其淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創木酚氧化酶這4種酶的酶活性高峰期交替出現，具有明顯的活性變化。由于試驗測定的時間較短，沒能更加完整的體現灰樹花培養期間酶活性變化的規律，有待今后進一步研究。