麗水錐栗林下大型真菌生態調查及分子鑒定

薛振文 高鳳娟 應國華 呂明亮 李伶俐

（1麗水市林業科學研究院，浙江麗水323000；2麗水學院，浙江麗水323000）

錐栗[Castanea henryi（Skam）Rehd.et Wils.]殼斗科（Fagaceae）栗屬，是浙西南尤其是浙江慶元縣的主要的經濟樹種，栽培面積達4000 hm2。錐栗是菌根共生樹種之一，在天然錐栗林中有菌根菌與之共生，形成互惠互利關系。目前生產中錐栗育苗主要采用實生苗培育后嫁接良種的繁殖方法，苗木質量參差不齊，優質苗木比例低，造林成活率低，幾乎沒有采用菌根技術接種菌根菌進行菌根苗的培育方式。研究擬通過錐栗林下外生菌根真菌種類的調查及與錐栗共生關系的研究，篩選出能與錐栗共生的菌根真菌種類，確定優勢菌根菌，為錐栗菌根苗的生產應用和開發利用菌根菌奠定基礎。

1 生態調查

1.1 生態條件

試驗調查地浙江麗水市慶元縣嶺頭鄉包裹村（海拔 1111 m，地理坐標為 27°32′23.25″N，119°14′21.34″E）和屏都街道余村（海拔409 m，地理坐標為 27°35′48.2″N，118°59′10.9″E）錐栗人工純林。錐栗品種為油榛、黃榛、烏殼長芒等優良家系，樹齡14～18年，盛產期；錐栗距地面10 cm處的直徑15.6 cm±3.4 cm，樹高6.2 m±1.4 m，郁閉度0.7～0.8。林地土壤為紅壤。當地屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫17.6℃，最熱月（7月）平均氣溫26.9℃，最冷月（1月）平均氣溫7℃，年平均降水量1746.9 mm，年均相對濕度77%，年平均無霜期255 d。

1.2 生態調查方法

沿路踏查選擇三塊大型真菌子實體較多的樣地，對每塊樣地采用普查方式進行研究。采用羅盤儀測量法測定樣地面積，采集樣地內大型真菌、分類編號A-F、統計數量、記錄和拍照。為證實子實體與錐栗是否共生關系，采集時沿子實體基部小心挖開表面土壤，在土壤的菌絲層中，仔細尋找菌絲或菌索來確認與錐栗根系相連，挖取20 cm×20 cm×20 cm帶土根系帶回實驗室內挑取菌根觀察形態。

2 分子鑒定材料與方法

2.1 分子鑒定材料

待分子鑒定的子實體編號為A、B、C、D。

2.2 分子鑒定方法

2.2.1 DNA的提取

采用改良的CTAB法[1]提取DNA，得到的DNA作為PCR擴增的模板。

2.2.2 PCR擴增

采用真菌rRNA基因的ITS區擴增通用引物ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）; 和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’）進 行PCR 擴增[2]。PCR 擴增體系包括（25 μL）：DNA 模板2 μL，引物ITSIF和ITS4各0.5 μL，10×PCR 緩沖液 2.5 μL，dNTPs 2 μL，rTaq 聚 合 酶 0.125 μL，ddH2O 25 μL。反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s；54℃退火30 s；72℃延伸45 s，32個循環；72℃終延伸5 min。PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳分離，并于凝膠成像系統下觀察并照相。

2.2.3 rDNA ITS序列測定與分析

上述PCR反應產物送金斯瑞測序公司進行測序。對測得的供試菌株rDNA ITS區段DNA序列運用GenBank中的BLAST工具軟件在DNA序列數據庫中搜索同源DNA序列并進行比較分析，根據BLAST搜索和比較的結果，判斷真菌的物種或與其近緣的物種。

3 結果與分析

3.1 生態調查

對分布于海拔400～1100 m的錐栗林調查發現有6種大型真菌。經菌索追蹤發現橙黃硬皮馬勃、芝麻厚瓤牛肝菌、雙型褶孔牛肝菌均與錐栗根系相連，可初步確定為菌根菌。橙黃硬皮馬勃是錐栗林最常發生的外生菌根菌，于6-10月發生，海拔越高馬勃發生越遲。充足降雨之后，連續3～5 d的高溫天氣子實體會大量發生。

圖1 標本A橙黃硬皮馬勃Scleroderma citrinum

圖2 標本B芝麻厚瓤牛肝菌Hourangia nigropunctata

圖3 標本C雙型褶孔牛肝菌Phylloporus dimorphus

圖4 標本D蠟蘑未知種

圖5 標本E 黑柄炭角菌Xylaria nigripes（Kl.）Sacc.

圖6 標本F雞Termitornyces sp.

為了研究菌根菌的優勢種類，統計了三塊樣地三種菌根菌的子實體發生量（表1），橙黃硬皮馬勃發生量最多，密度達0.0875個/㎡，可以確定橙黃硬皮馬勃為調查樣地的優勢菌根菌；調查發現在低海拔的錐栗林下比高海拔條件下橙黃硬皮馬勃發生密度更大，發生時間更早。芝麻厚瓤牛肝菌和雙型褶孔牛肝菌僅僅發生在高海拔1111 m錐栗林下，芝麻厚瓤牛肝菌和雙型褶孔牛肝菌發生平均密度分別為0.0343個/㎡、0.0272個/㎡，為高海拔錐栗林下較優勢菌根菌。

表1 菌根菌發生量統計

調查發現位于屏都街道余村的錐栗林地套種黃精和竹蓀后，當年橙黃硬皮馬勃子實體發生量顯著減少，且均發生于未耕作的邊坡。第四年后橙黃硬皮馬勃發生量明顯增多，原因可能是松土耕作對錐栗菌根發育造成影響，從而影響橙黃硬皮馬勃子實體發生。

3.2 子實體分子鑒定

表2 子實體分子鑒定結果

Hourangia nigropunctata和Phylloporus dimorphus中文名經咨詢楊祝良老師獲得，分別為芝麻厚瓤牛肝菌和雙型褶孔牛肝菌。子實體形態描述參見文獻[3，4]。

據報道[3]芝麻厚瓤牛肝菌在我國發現地域有云南的騰沖市，江城縣、景洪縣、湖南省宜章縣，福建省三明市，海南省樂東縣，貴州省道真縣，海拔在1300～1900 m的松屬、栲屬、石櫟屬、櫟屬林地內。筆者在海拔1111 m的錐栗純林下發現該牛肝菌，首次報道栗屬的錐栗為芝麻厚瓤牛肝菌的共生樹種。據報道[4]雙型褶孔牛肝菌僅發現于泰國北部栲屬林地內，筆者首次在栗屬錐栗純林下發現，國內未發現該牛肝菌的報道。

利用ITS序列分析結果表明：標本編號為D的子實體（圖4）與酒色蠟蘑相似率僅為76%，可能為一種近似種或新種，經菌絲或菌索追蹤未發現與錐栗根系相連，子實體周圍有較厚的落葉層，推測非菌根菌。

4 結論與討論

在慶元錐栗林地調查發現與錐栗共生的菌根菌種類有橙黃硬皮馬勃、芝麻厚瓤牛肝菌和雙型褶孔牛肝菌。低海拔條件下菌根菌發生時間早，高海拔條件下發生時間晚且種類較多。

在高、低海拔地區，橙黃硬皮馬勃均為錐栗的優勢菌根菌，建議采用接種有橙黃硬皮馬勃的錐栗苗造林，既能促進錐栗生長，又能收獲橙黃硬皮馬脖子實體。

芝麻厚瓤牛肝菌或雙型褶孔牛肝菌菌種分離、擴繁、菌根合成等技術有待繼續研究，進而在高海拔地區營造菌根林，達到收獲子實體和促進錐栗苗生長的目標。

由于土壤耕作破壞錐栗根系上菌根的生長發育，橙黃硬皮馬勃發生明顯減少，而邊坡未耕作區仍然能發生子實體。

挖取的菌根經處理后解剖鏡下挑取，觀察菌根形態，由于野生菌根種類復雜，菌根發育期菌根形態差異較大等原因無法肉眼鑒定出菌根菌類型，需要借助分子手段，有待繼續研究。