淋球菌體外感染單個核細(xì)胞對IL-1β、NLRP3表達(dá)的影響

陳劍云 張 方 陽慧芝 陳嶸祎

淋病奈瑟菌(簡稱淋球菌)是一種革蘭陰性雙球菌，人類是唯一自然宿主。其主要侵犯泌尿生殖黏膜,引起宮頸、宮腔、尿道、輸卵管及盆腔感染，但女性患者大多表現(xiàn)為無癥狀，除了延誤治療引發(fā)不孕等嚴(yán)重后遺癥，更會加速淋病蔓延甚至促進(jìn)HIV感染。淋球菌感染的活菌數(shù)量是影響實(shí)驗(yàn)效果的關(guān)鍵指標(biāo)，添加經(jīng)過定量的活菌有利于實(shí)驗(yàn)效果的評估及提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，并有利于炎癥因子表達(dá)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。然而淋球菌感染實(shí)驗(yàn)如何定量，淋球菌體外感染單核細(xì)胞對炎癥因子的影響，特別是IL-1β、NLRP3(核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3)表達(dá)的研究目前國內(nèi)未見報(bào)道。本文通過研究淋球菌定量方法以及不同濃度淋球菌感染單個核細(xì)胞對IL-1β、NLRP3表達(dá)的影響，為淋球菌感染致病機(jī)制研究及該病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株、C57/BL6J小鼠 淋球菌菌株，購于上海宜醇化工有限公司(菌種編號19424)，C57/BL6J小鼠，購于廣東省醫(yī)學(xué)動物中心。

1.1.2 主要儀器與試劑 SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo SCIENTIFIC公司)，高速低溫臺式離心機(jī)(美國Thermo公司)、VininTM7 Dx Real-Time PCR儀(Life)、倒置顯微鏡(CKX41，OLYMPUS)、分光光度計(jì)(德國Eppendorf公司)；小鼠單個核細(xì)胞分離液(LTS1092PK-200,天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)、淋球菌選擇培養(yǎng)基(15098，江門凱林公司)、澳洲源胎牛血清(10099-141，Gibco公司)、RPMI 1640完全培養(yǎng)基(C11875500BT，Gibco公司)、PBS, pH 7.2(20012-043，Gibco公司)、Trizol、qRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa)、SYBR? Premix ExTaqTMII(Tli RNaseH Plus)(RR820A，Takala公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌液OD值測定 將淋球菌接種于淋球菌選擇培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用接種環(huán)挑取單個菌落于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中制成細(xì)菌懸液。以未加菌的培養(yǎng)液為空白對照液調(diào)零，波長450 nm測量OD值，選取OD值在0.6～1.0之間的菌液進(jìn)行1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0梯度稀釋，并測量其OD450值。

1.2.2 菌落平板計(jì)數(shù) 將各組菌液進(jìn)行10、102、……10n倍比稀釋，吸取1 mL稀釋后的菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。選取培養(yǎng)基上菌落數(shù)為30～300 CEU/mL為最佳稀釋倍數(shù)10n，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)10n，為1 mL菌液中的活菌數(shù)(CEU/mL)，即菌液中淋球菌活菌的濃度。

1.2.3 回歸方程計(jì)算 以菌落數(shù)為y值，菌液OD450值為x值，計(jì)算相關(guān)回歸方程。

1.2.4 小鼠脾臟單個核細(xì)胞獲取 于超凈工作臺中無菌操作取出C57/BL6J小鼠脾臟，以PBS漂洗2次后，以磨砂玻片輕輕研磨，用細(xì)胞篩過濾獲得細(xì)胞懸液4 mL。將細(xì)胞懸液移至已盛有單個核細(xì)胞分離液的濾液離心管中，細(xì)胞懸液與單個核細(xì)胞分離液體積之比為1∶4，以500×g離心30 mim，分四層，取上數(shù)第二層，即單個核細(xì)胞層。加入適量PBS液漂洗1次，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，吹打混勻2 min，再加入PBS漂洗1次即可獲得高純度的單個核細(xì)胞。

1.2.5 RT-qPCR檢測IL-β、NLRP3基因表達(dá) 將OD450值為0.2、0.6、1.0、1.4的淋球菌菌液與單個核細(xì)胞置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中共培養(yǎng)6 h，為感染組；設(shè)置不加淋球菌的空白對照組計(jì)OD450值為0。培養(yǎng)結(jié)束后，采用梯度離心去除淋球菌，收集單個核細(xì)胞。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SYBY Green核酸染料為熒光探針，用Real-time PCR檢測細(xì)胞IL-1β的表達(dá)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參照，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)檢測熒光信號。每個樣品均設(shè)置3個復(fù)管，重復(fù)試驗(yàn)三次。分別測定對照組和試驗(yàn)組目的基因與內(nèi)參基因的Ct值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其均值，按照2-△△Ct相對定量公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)組相對于空白組的各基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，其中△△Ct=(實(shí)驗(yàn)組目的基因平均Ct值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct值-對照組內(nèi)參基因平均Ct值)。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 建立淋球菌OD450值(x)——菌落數(shù)(y)回歸方程 經(jīng)過計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上菌落數(shù)目，選擇最佳稀釋倍數(shù)為106，計(jì)數(shù)此稀釋倍數(shù)下不同OD值菌液接種于固體培養(yǎng)上的菌落數(shù)，計(jì)算OD值與菌落數(shù)的回歸方程。見表2。

表2 淋球菌菌落平板計(jì)數(shù)

2.2 不同濃度淋球菌感染單個核細(xì)胞對IL-1β、NLRP3表達(dá)的影響 實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，目的基因與內(nèi)參基因的熔解曲線峰均為單一峰且峰形銳利，未見其他峰值。擴(kuò)增曲線均光滑平穩(wěn)，熒光吸收圖譜的S形曲線圖形狀完整，符合定量檢測要求。相對定量分析顯示，將菌液OD450值為0的空白對照組IL-1β基因表達(dá)量設(shè)為1，則感染組IL-1β基因相對表達(dá)量隨淋球菌濃度升高出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，感染6 h菌液OD值為0.6的實(shí)驗(yàn)組IL-1β基因相對表達(dá)量最高，而感染6 h菌液OD值為1.0的實(shí)驗(yàn)組NLRP3基因相對表達(dá)量最高(圖1)。

3 討論

淋球菌LOS(脂寡糖)與DC(樹突狀細(xì)胞)的TLR4受體結(jié)合經(jīng)MAPKs、NF-кB、IRF3信號傳導(dǎo)通路激活固有免疫，誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNFα產(chǎn)生；接著DC啟動適應(yīng)性免疫分泌IL-23、前列腺素(PGE2)上調(diào)CD4+T趨化因子受體，促進(jìn)RORγt表達(dá)來使T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞；最終分泌大量IL-17A、IL-17F并引起中性粒細(xì)胞趨化至病灶吞噬淋球菌，促使活性氧(ROS)產(chǎn)生及iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)合成NO，誘導(dǎo)抗菌肽釋放，以清除淋球菌[1-4]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)雌二醇可下調(diào)淋球菌感染誘導(dǎo)的人HeLa中il-6、il-8、nlrp3 mRNA等趨化因子、促炎因子的表達(dá)起到抑制黏膜免疫及使單核細(xì)胞無法趨化至病灶來殺滅淋球菌，促進(jìn)其感染的作用[5]。因?yàn)椴煌瑵舛鹊牧芮蚓罹碳魏思?xì)胞可引起各種炎癥因子的表達(dá)出現(xiàn)各異，摸索合適的淋球菌定量感染條件不僅能使炎癥因子表達(dá)更穩(wěn)定，更有利于淋球菌對宿主感染免疫影響的研究，還有利于提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。因此我們使用了不同濃度淋球菌體外感染單核細(xì)胞對IL-1β、NLRP3表達(dá)影響進(jìn)行了相關(guān)研究。

1a：感染6 h后IL-1βmRNA的表達(dá)；1b：感染6 h后NLRP3 mRNA的表達(dá)

圖1 PCR結(jié)果

淋球菌有黏附宿主黏膜的特性，感染人類泌尿生殖道主要表現(xiàn)為局部黏膜反應(yīng)，大部分為固有免疫反應(yīng)[2]。固有免疫包括4種模式識別受體，其中的NOD樣受體(NOD like receptor, NLRs)能識別淋球菌表面糖蛋白，激活下游分子進(jìn)而活化NF-κB和MAPK通路以及參與炎性小體的組成與活化誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-1、TNF等[6-8]。NLRP蛋白家族作為NLRs家族中最大的一個亞族，分布廣泛，典型代表NLRP3受到相應(yīng)刺激后，在胞內(nèi)組裝成炎性小體，通過街頭蛋白ASC募集促Caspase酶快速轉(zhuǎn)化為活性的蛋白酶，導(dǎo)致促炎因子IL-1釋放以及細(xì)胞死亡[9]。國外有研究證實(shí)淋球菌可通過組織蛋白酶B蛋白水解酶激活NLRP3炎癥復(fù)合物/ASC/Caspase-1軸來促進(jìn)IL-1β分泌[10]。與上述研究相一致的是本實(shí)驗(yàn)通過檢測被不同濃度淋球菌感染的單個核細(xì)胞中IL-1β、NLRP3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)淋球菌感染單核細(xì)胞后均可導(dǎo)致IL-1β、NLRP3 mRNA表達(dá)增高，且在菌液OD450值分別為0.6、1.0刺激單個核細(xì)胞6小時(shí)后IL-1β、NLRP3基因相對表達(dá)量較高。表明本研究感染實(shí)驗(yàn)成功，為日后淋球菌體外感染單個核細(xì)胞提供了重要的實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。

雖然我們研究表明淋球菌感染可明顯上調(diào)NLRP3并促進(jìn)單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，但NLRP3是否是單核細(xì)胞抵抗淋球菌主要受體？Toll樣受體與NOD樣受體在淋球菌感染中何種受體起的作用大？上述問題仍有待進(jìn)一步研究。