補充維生素D3協同第二代抗組胺藥物治療慢性自發性蕁麻疹的臨床療效觀察和作用機制研究

易 紅 宋玉杰 江 珊 史 贏 萬 靜 雷鐵池

近60%～70%的慢性自發性蕁麻疹(chronic spontaneous urticaria，CSU)很難找到確切致敏原因[1]。第二代抗組胺藥是治療CSU的主要藥物。然而，一些CSU患者對單一抗組胺藥物治療反應較差，停藥后皮疹再發[2]。近年來發現約91.3%的CSU患者存在VD3不足甚至缺乏[3]。本研究比較CSU患者補充VD3后對抗組胺藥物治療反應性的變化，旨在探討VD3在CSU發病中的作用以及協同治療CSU的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 90例CSU和21例CIndU患者均來自2017年10月至2018年10月武漢大學人民醫院皮膚科門診，另招募55名健康自愿者(均排除自身免疫性疾病和過敏性疾病等)作為健康對照組。三組人群性別和年齡構成比基本相似。CSU患者的入選標準及排除標準參照文獻[3,4]。本研究經武漢大學人民醫院醫學倫理委員會批準，入組前所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 Ficoll淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限公司)，植物血凝素(PHA)、1α,25-(OH)2D3(美國Sigma公司)，胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液(上海碧云天生物技術研究所)，CCK-8試劑盒(廣州奕元生物科技有限公司)，RPMI 1640培養基、Trizol、RT-PCR試劑盒(美國Invitrogen公司)，實時熒光定量PCR試劑盒(大連Takara公司)，CFX connect熒光實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 分組與VD3補充治療 入組時所有入組患者和健康對照組進行血清25-(OH)D3、D-dimer、FDP、ESR水平測定。入組患者填寫關于UAS7評分的量表。依據文獻報道[5], 25-(OH)D3<10 ng/mL被認定為嚴重缺乏，10～20 ng/mL為缺乏，20～30 ng/mL為不足，≥30 ng/mL為正常。UAS7總分為42分，0～14分為輕度，15～28分為中度，29～42分為重度[6]。

將VD3嚴重缺乏及缺乏的CSU患者隨機分為對照組和治療組，對照組僅用一種第二代抗組胺藥，治療組除第二代抗組胺藥外補充VD3。VD3嚴重缺乏組的治療組每天補充2400 IU VD3，6周后復測VD3并調整用量，再治療6周，而VD3缺乏組的治療組每天補充800 IU VD3，6周后減為400 IU維持治療6周。所有患者均在6和12周復診，進行UAS7評分，并監測不良反應的發生。治療中如發現有25-(OH)D3>100 ng/mL，血鈣>2.52 mmol/L，停止補充VD3。

1.4 CCK-8法檢測PBMC增殖率 PBMC分離后，以(1～2)×106/mL濃度接種于96孔板中，加入不同濃度的PHA(終濃度分別為1、3、10、30、100 μg/mL)及空白組(培養基)，于37 ℃，5% CO2，飽和濕度培養箱培養69 h，每孔加入CCK-8 20 μL后繼續培養3 h，在酶標儀450 nm處測定吸光值(OD)。細胞增殖率(%)=(OD處理組-OD對照組)/OD對照組×100%。

1.5 PBMC分離與體外培養 抽取15例CSU及15名健康自愿者靜脈血10 mL，用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。1α,25-(OH)2D3溶解于DMSO。根據預實驗結果和參照文獻[7],選用對細胞增殖無影響的兩個濃度(1 nM和10 nM 1α,25-(OH)2D3)處理體外培養的PBMC。將CSU患者PBMC分為3組，分別加入含10 μg/mL PHA(含等體積的DMSO)，10 μg/mL PHA +1 nM 1α,25-(OH)2D3和10 μg/mL PHA +10 nM 1α,25-(OH)2D3的RPMI 1640培養基，于37 ℃，5% CO2，飽和濕度培養箱培養72 h。離心后收獲細胞用于細胞總RNA抽提。

1.6 qPCR檢測PBMC IL-6和VDR mRNA水平 用Trizol法抽提PBMC總RNA。取1.5 μg總RNA進行逆轉錄，逆轉錄反應體系為20 μL，反應條件：37℃ 10 min，37℃ 50 min，70℃ 15 min，4℃維持。引物序列：人IL-6，正義，5-TCAGCCCTGAGAAAGGAGACAT-3；反義，5-GCTCTGGCTTGTTCCTCACTACT-3；人VDR，正義，5-CAAGGACAACCGACGCCA-3；反義，5-TCCCTCCACCATCATTCACAC-3；內參GAPDH，正義，5-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3；反義，5-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3。實時熒光定量PCR反應體系為20 μL，反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火40 s，70℃延伸30 s，擴增40個循環。熔解曲線的反應條件為：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

1.7 其他檢測方法 血漿D-dimer、FDP(免疫比濁法)，ESR(快速血沉法)，血清25-(OH)D3水平(超高效液相色譜-串聯質譜法)等均由本院臨床檢驗中心完成。自體血清皮膚試驗(ASST)和自體血漿皮膚試驗(APST)參照本實驗室以前報道的方法[8]。

2 結果

2.1 受試者血清25-(OH)D3水平， 3個炎性指標和蕁麻疹嚴重程度UAS7評分之間相關分析 與健康對照組相比，血清25-(OH)D3水平測定結果顯示90例CSU患者(U=1189,P<0.0001)和21例CIndU患者(U=357.0,P<0.05)均呈明顯降低，但3個炎癥指標(D-dimer、FDP、ESR)僅在CSU組中均增高明顯，見表1。在CSU患者中，25-(OH)D3嚴重缺乏者占 31%(28/90)，缺乏者56%(50/90)；在CIndU患者中，嚴重缺乏者占14%(3/21)，缺乏為57%(12/21)；55名健康對照中，嚴重缺乏者僅占4%(2/55)，缺乏為35%(19/55)。我們的數據還顯示3個炎癥指標(D-dimer、FDP、ESR)與UAS7呈正相關，結果提示部分CSU患者可能存在VD3嚴重缺乏和全身性炎癥。

2.2 CSU患者與健康對照組IL-6 mRNA和VDR mRNA表達水平比較 15例CSU患者中，IL-6 mRNA表達水平有7例患者明顯高于健康自愿者，1例明顯低于健康志愿者，7例無明顯差異；VDR mRNA表達水平有13例患者較健康自愿者明顯增加，2例無明顯差異，見表2。體外培養PBMC試驗顯示隨著VD3處理濃度增加，IL-6 mRNA表達水平減低，而VDR表達水平增加(圖1)。結果提示VD3能抑制淋巴細胞釋放促炎因子IL-6，增加VDR表達。

2.3 補充與未補充VD3的CSU患者蕁麻疹嚴重程度UAS7評分變化 14例VD3嚴重缺乏的CSU患者與未補充對照組比較，在治療后12周UAS7評分明顯下降(P<0.0001)(圖2)。而25例VD3缺乏的CSU患者與未補充對照組治療后6、12周UAS7評分均下降不明顯(P>0.05)。

表1 慢性自發性蕁麻疹、慢性可誘導性蕁麻疹及健康對照組25-(OH)D3、D-二聚體(D-dimer)、纖維蛋白降解產物(FDP)、ESR的檢測結果[M(P25,P75)]

注：a：與健康對照組比較P<0.0001；b：與健康對照組比較P<0.01；c：與健康對照組比較P<0.05

圖1 不同濃度的1α,25-(OH)2D3處理后CSU患者PBMC IL-6(a)、VDR mRNA(b)表達(注：*：P<0.05，**：P<0.01)

圖2 VD3嚴重缺乏組治療效果的比較

表2 慢性自發性蕁麻疹及健康對照組IL-6 mRNA和VDR mRNA表達[M(P25，P75)]

3 討論

表皮基底層和棘層角質形成細胞中的7-脫氫膽固醇經UVB介導的光化學作用合成內源性VD3是人體VD3來源的主要途徑[9]。然而，過度皮膚防曬、戶外運動減少、肥胖等可能是內源性VD3合成不足的主要原因[10,11]。本研究結果顯示31% CSU，14% CIndU和4%正常人血清VD3水平呈嚴重缺乏，且蕁麻疹嚴重程度UAS7評分與3個炎癥指標(D-dimer、FDP、ESR)呈正相關。本研究還發現CSU患者中65%為女性，女性患者VD3水平明顯低于男性。Woo等[12]報道UAS7評分與血清VD3水平呈負相關，他們還觀察到10例VD嚴重缺乏的急性蕁麻疹患者有5例最后發展成為CSU。以上高度提示VD3嚴重缺乏可能是CSU疾病發生發展的風險因素之一。

有研究顯示CSU患者可能存在一種低水平或亞臨床的全身性炎癥反應[13]。VD3通過上調MKP-1途徑來抑制單核細胞或巨噬細胞中p38的活化以及IL-6和TNF-α的表達，發揮一定的抗炎作用[14]。我們用qPCR技術測定15例CSU外周血分離PBMC的IL-6和VDR mRNA表達水平，與正常人PBMC進行比較，結果發現CSU患者的IL-6和VDR mRNA均高于健康對照組，體外PBMC的1α,25-(OH)2D3處理組與未處理組比較，IL-6 mRNA表達減低而VDR mRNA增加。這一結果也支持了我們的假設，VD3在CSU治療中可能存在一定的抗炎作用。越來越多的研究證實經VD與細胞核內VDR結合后可能通過以下機制發揮抗炎、抗過敏作用：①VD可以刺激肥大細胞VDR表達，阻止了Lyn與FcεRI的β鏈以及MyD88的結合，抑制IgE介導的肥大細胞活化，維持肥大細胞膜的穩定[15]；②VDR與MKP-1基因上游的VDRE結合，可能影響MKP-1轉錄，上調MKP-1的表達[14]；③除1,25-(OH)2D3外，體內可能還存在有與VDR結合尚未識別的分子，發揮抗炎活性[16]。

通過對CSU患者進行蕁麻疹嚴重程度UAS7評分發現，VD3缺乏組與嚴重缺乏組的患者分別補充小劑量和大劑量的VD3，并與單用抗組胺藥組比較，在補充治療后第12周，VD3嚴重缺乏組UAS7評分較對照組顯著下降，同時測定血清VD3水平均較補充前明顯增加。VD3缺乏組UAS7評分與對照組比較無統計學意義，提示這組患者可能還存在有其他致病因素如亞臨床炎癥和凝血功能紊亂等[13]。

綜上，血清VD3水平缺乏甚至嚴重缺乏是CSU病情發生發展的風險因素之一。VD3通過與核內VDR結合，抑制促炎因子如IL-6的釋放。補充VD3有助于控制CSU，尤其是VD3嚴重缺乏患者的臨床癥狀。我們還發現CSU患者PBMC的VDR表達水平較正常人明顯增高，推測可能是一種VD3配體不足所致的代償性增加，其分子機制有待進一步檢查。