天麻素在L6肌管中促進葡萄糖消耗的作用和機制研究

張勇 孔維佳

[摘要] 目的 研究天麻素（GSTD）在L6肌管中促進葡萄糖消耗的作用和可能機制。 方法 體外培養大鼠L6骨骼肌細胞并誘導分化成肌管，血清饑餓后以GSTD單獨處理或與濃度為0.05 nmol/L的胰島素聯合處理24 h，以二甲雙胍（Met）為陽性對照藥。部分實驗中L6肌管先以濃度為100 nmol/L的胰島素處理24 h以誘導胰島素抵抗，再進行藥物處理。以試劑盒測定細胞糖消耗、L-乳酸釋放和ATP產生，以Western blot和實時熒光定量反轉錄PCR檢測目標蛋白和基因的表達水平。 結果 GSTD濃度依賴性地促進L6肌管的基礎糖消耗[與對照細胞比較，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）]，并且顯著增加胰島素刺激的糖消耗[與單用胰島素或GSTD處理的細胞比較，差異有統計學意義（P < 0.05）]。在胰島素抵抗狀態下，濃度為500 μmol/L的GSTD仍能有效促進細胞糖消耗（P < 0.05）。Met處理后顯著增加細胞的L-乳酸釋放并抑制ATP產生[與對照細胞比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）]，但GSTD沒有作用。GSTD顯著上調L6肌管GLUT4蛋白和mRNA的表達，并且激活AMPK和Akt通路，表現為處理后p-AMPKα和p-Akt的水平顯著增加[與對照細胞比較，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）]。 結論 GSTD作用于L6肌管顯著增加其糖消耗并能克服胰島素抵抗，其機制可能與GLUT4的上調以及AMPK和Akt通路的激活有關。

[關鍵詞] 天麻素;葡萄糖消耗;胰島素抵抗;糖酵解;葡萄糖轉運蛋白4;AMP依賴的蛋白激酶

[中圖分類號] R587.1;R284.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（a）-0022-04

[Abstract] Objective To investigate the activities and possible mechanisms of gastrodin （GSTD） to promote glucose consumption in L6 myotubes. Methods Rat L6 skeletal muscle cells were cultured in vitro and differentiated into myotubes. After serum starvation， GSTD was used to treat the myotubes for 24 h， either alone or in combination with insulin at a concentration of 0.05 nmol/L. Metformin （Met） was used a positive control drug. In some experiments， L6 myotubes were treated with 100 nmol/L of insulin for 24 h to induce insulin resistance before drug treatment. Commercial kits were used to determine cell glucose consumption， L-lactate release， and ATP production. The expression levels of target proteins and genes were determined by Western blot and real-time quantitative reverse transcription-PCR （RT-PCR）. Results GSTD promoted the basal glucose consumption of L6 myotubes in a concentration-dependent manner [comparing with control cells， the diferences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）]. In addition， GSTD greatly increased the insulin-stimulated glucose consumption [comparing with cells treated with insulin or GSTD alone， the diferences were statistically significant （P < 0.05）]. In a state of insulin resistance， GSTD at a concentration of 500 μmol/L was still effective to promote cell glucose consumption （P < 0.05）. After treatment， Met significantly increased cellular L-lactate release but decreased ATP production [comparing with control cells， the diferences were highly statistically significant （P < 0.01）]. However， GSTD did not have such effects. GSTD greatly up-regulated the protein and mRNA expression levels of GLUT4 in L6 myotubes. In addition， it activated the AMPK and Akt pathways， as indicated by the significant increase of p-AMPKα and p-Akt levels after treatment [comparing with control cells， the diferences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）]. Conclusion When used to treat L6 myotubes， GSTD greatly increases glucose consumption and is able to overcome insulin resistance. The mechanisms may be associated with the up-regulation of GLUT4 as well as the activation of AMPK and Akt pathways.

[Key words] Gastrodin; Glucose consumption; Insulin resistance; Glycolysis; Glucose transporter 4; AMP-activated protein kinase

天麻素（GSTD）是蘭科植物天麻的主要有效成分之一，具有多種藥理作用。有研究發現GSTD在鏈脲佐菌素（STZ）誘導的小鼠糖尿病模型中能有效降低空腹血糖[1]。筆者實驗室的研究也發現，GSTD用于治療KK-Ay糖尿病小鼠能顯著降低空腹血糖，改善葡萄糖耐量并增加胰島素敏感性[2]。但目前GSTD在細胞水平對葡萄糖代謝的具體作用尚不明確，因此本文在體外培養的大鼠L6骨骼肌細胞中研究其對葡萄糖代謝的影響和機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

GSTD購自浙江誠意藥業股份有限公司（批號：20150812，純度≥98%）;二甲雙胍（Met）（PHR1084）和人胰島素溶液（I9278）購自美國Sigma公司;DMEM培養基（11965092）和胎牛血清（FBS）（10100147）購自美國Gibco-Invitrogen公司。葡萄糖檢測試劑盒（己糖激酶法）（GL1611）購自英國Randox公司;L-乳酸測定試劑盒（E0139084）購自北京九強生物技術股份有限公司;ATP含量測定試劑盒（A095）購自南京建成生物工程研究所。葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）（#2213）、AMP依賴的蛋白激酶α（AMPKα）（#5832）、p-AMPKα（Thr172）（#2531）、Akt（#4691）、p-Akt（Ser473）（#4058）和β-肌動蛋白（ACTB）（#4970）的鼠源或兔源單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。細胞RNA提取（LS1040）、定量（E3310）、反轉錄（A3500）和實時熒光定量PCR（A6001）試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和處理? 大鼠L6骨骼肌細胞以DMEM培養基+10% FBS，于37℃、5%CO2的環境進行培養，細胞傳代后生長至70%～80%融合時按文獻[3-4]報道誘導分化直至出現肌管。L6肌管在無血清DMEM培養基中饑餓12 h然后進行相應處理，時間為24 h，所有處理組均設4個復孔。

1.2.2 糖消耗測定? L6細胞以5×104/孔的密度接種于96孔板，誘導分化并處理后收集培養液，以500 g離心5 min（半徑13.5 cm），收集上清液以試劑盒測定其中葡萄糖濃度并按照文獻[3-4]報道的方法計算細胞糖消耗。對于胰島素抵抗狀態下的糖消耗實驗，L6肌管先以濃度為100 nmol/L的胰島素處理24 h以誘導胰島素抵抗[5]，再做相應處理后測定細胞糖消耗，胰島素敏感的L6肌管同時處理作為對照。

1.2.3 L-乳酸和ATP測定? L6細胞以2×105/孔的密度接種于12孔板，誘導分化并處理后收集培養液，以500 g離心5 min（半徑13.5 cm），收集上清液以試劑盒測定其中L-乳酸的濃度。同時收集細胞，勻漿后以試劑盒測定其中的ATP濃度，結果以樣品的蛋白含量進行校正。

1.2.4 Western blot? L6細胞以1×106/孔的密度接種于6孔板，誘導分化并處理后按照文獻[3]報道的方法提取細胞總蛋白，定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和Western blot檢測。按文獻[3]報道的方法對蛋白條帶進行掃描和定量，以ACTB為內參對GLUT4的表達水平進行校正，以AMPKα或Akt為內參對p-AMPKα和p-Akt的表達水平進行校正。所有靶蛋白的表達水平均以對照細胞的倍數表示。

1.2.5 細胞RNA提取、反轉錄和實時熒光定量PCR? L6細胞接種于6孔板，誘導分化并處理后以試劑盒提取細胞總RNA，定量后取1 μg為模板進行反轉錄，反應體系和條件參考文獻[3]報道。以Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System進行擴增，引物和反應條件參考文獻[3-4]報道。以ACTB為內參校正，以比較循環閾值（Ct）法對GLUT4 mRNA的表達水平進行相對定量，結果以對照細胞的倍數表示。

1.3 統計學方法

以GraphPad Prism 6軟件進行統計分析，計量資料以3次獨立實驗的均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GSTD顯著促進L6肌管的糖消耗

如圖1A所示，GSTD處理后顯著促進L6肌管的基礎糖消耗，其作用呈濃度依賴性。125 μmol/L的GSTD即可使細胞糖消耗產生有統計意義的增加[與對照細胞比較，差異有統計學意義（P < 0.05）]，當其濃度達到500 μmol/L時，可使糖消耗較對照細胞平均升高約47.4%（P < 0.01）。除了基礎糖消耗，GSTD作用于L6肌管還顯著增加胰島素刺激的糖消耗。如圖1B所示，濃度為0.05 nmol/L的胰島素與500 μmol/L的GSTD聯合處理后，細胞糖消耗較二者單獨處理增加更為明顯（P < 0.05）。濃度為5 mmol/L的陽性對照藥Met也顯著促進L6肌管的基礎糖消耗和胰島素刺激的糖消耗，其作用與500 μmol/L的GSTD相當。

與胰島素敏感細胞比較，濃度為100 nmol/L的胰島素處理后生理鹽水組細胞的基礎糖消耗出現有統計意義的減少（P < 0.05或P < 0.01），而且再以0.05 nmol/L的胰島素處理，細胞糖消耗不能增加，提示胰島素抵抗狀態誘導成功（圖1C）。濃度為500 μmol/L的GSTD和5 mmol/L的Met在胰島素抵抗狀態下也能增加L6肌管的糖消耗[與生理鹽水處理的胰島素抵抗細胞比較，差異有統計學意義（P < 0.05）]，但藥效較同樣處理的胰島素敏感細胞弱（P < 0.05）。

A：L6肌管基礎糖消耗。與對照細胞比較，*P < 0.05，**P < 0.01。B：胰島素刺激的糖消耗。與對照細胞比較，**P < 0.01;與單用胰島素、GSTD或Met的細胞比較，#P < 0.05。C：胰島素抵抗狀態下的糖消耗。與生理鹽水處理的胰島素敏感細胞比較，**P < 0.01;與相同處理的胰島素敏感細胞比較，#P < 0.05，##P < 0.01;與生理鹽水處理的胰島素抵抗細胞比較，$P < 0.05。GSTD：天麻素;Met：二甲雙胍

2.2 GSTD不影響L6肌管的糖酵解

Met顯著增加L6肌管L-乳酸的釋放并抑制ATP產生[與對照細胞比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）]。而各濃度的GSTD對L6肌管的L-乳酸（圖2A）和ATP（圖2B）的產生均沒有影響，提示其不影響細胞糖酵解。

2.3 GSTD顯著上調L6肌管GLUT4的表達并激活AMPK和Akt通路

GSTD處理后濃度依賴性地上調L6肌管GLUT4蛋白（圖3A）和mRNA（圖3B）的表達[與對照細胞比較，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）]。GSTD還能激活L6肌管的AMPK和Akt信號通路，表現為p-AMPKα（Thr172）和p-Akt（Ser473）的水平顯著增加[與對照細胞比較，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）]。濃度為5 mmol/L的Met上調GLUT4、激活AMPK和Akt的作用與500 μmol/L的GSTD相當。

3 討論

本研究探討了GSTD在L6骨骼肌細胞中調控糖代謝的作用和初步機制，并首次報道了其促進細胞糖消耗的作用和對GLUT4表達的上調作用。

本研究發現GSTD增加細胞糖消耗的機制與Met不完全相同。Met能通過抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ來抑制葡萄糖的有氧氧化和ATP合成，從而促進葡萄糖的無氧酵解和乳酸釋放，增加細胞糖消耗[4]。而GSTD對細胞糖酵解和ATP的產生沒有影響，提示其對細胞的線粒體功能不產生抑制作用。事實上，有研究發現GSTD在神經細胞中能改善線粒體功能并增加線粒體膜電位[6]。

GSTD增加L6肌管糖消耗的作用與GLUT4的上調以及AMPK和Akt的激活有關。筆者實驗室以前的研究發現GSTD作用于肝細胞能顯著激活AMPK[7]，另有研究發現GSTD作用于心肌細胞能激活Akt通路[8]，本研究結果與之相符。GLUT4是L6細胞中最主要的葡萄糖轉運載體[9-10]，AMPK和Akt是調控糖代謝的關鍵激酶，激活后二者均能促進GLUT4的細胞膜轉位，從而刺激細胞對葡萄糖的攝取和消耗[11-14]。目前GSTD對L6肌管GLUT4轉位和葡萄糖攝取的影響以及與AMPK和Akt信號通路的相關性尚屬未知，需進行深入研究。

除了基礎糖消耗，GSTD還顯著增加胰島素刺激的糖消耗并且在胰島素抵抗的L6肌管中仍具有促進糖代謝的活性，這些體外實驗的結果與其在動物實驗中的胰島素增敏作用相符合[2，15]。GSTD增加胰島素敏感性和改善胰島素抵抗的分子機制尚不明確，有可能與其抑制同型半胱氨酸的作用[16]以及抗炎和抗氧化活性[7]有關。筆者實驗室正就GSTD的胰島素增敏作用和對胰島素信號通路的影響進行深入研究。

綜上所述，本研究結果提示GSTD作用于L6骨骼肌細胞能顯著促進基礎糖消耗和胰島素刺激的糖消耗，并且在胰島素抵抗狀態下仍然有效，其作用機制與糖酵解無關，但可能與GLUT4表達上調以及AMPK和Akt通路的激活有關。結合其在糖尿病動物模型中的良好效果[1-2]，GSTD在將來有可能開發成為新型的口服降糖藥。

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（收稿日期：2018-06-12? 本文編輯：張瑜杰）