固相支撐液液萃取結合超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定尿液中7種多環芳烴代謝物

陳雪蕾，李冬梅，徐厚君，王學生，王曼曼*

(1.華北理工大學 公共衛生學院，河北 唐山 063210；2.華北理工大學 藥學院，河北 唐山 063210)

多環芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一類分子結構中含有兩個或兩個以上苯環的碳氫化合物，是典型的持久性有機污染物[1]。PAHs種類多、分布廣，具有“三致”毒性，已被國際癌癥研究機構(IARC)確認為第一組致癌物質[2-3]。PAHs廣泛分布于污染的空氣、水體、土壤、食物和煙草煙霧等介質中，相對于一般環境，PAHs暴露接觸濃度和暴露劑量在職業環境中尤為突出[4-5]。PAHs可經呼吸道、消化道和皮膚等多種途徑進入機體，對人體健康造成有害影響，有研究表明PAHs暴露與肺癌、膀胱癌和女性乳腺癌等多種癌癥的發生有關[3,6-7]，因此獲得準確PAHs暴露水平是進行PAHs健康評價以及安全控制的前提。

進入人體內的PAHs經肝臟代謝并轉化為結合態的羥基多環芳烴(Hydroxyl polycyclic aromatic hydrocarbons，OH-PAHs)，隨后經尿液或糞便排出體外[8]。考慮到PAHs暴露途徑多樣化，同時尿液樣品無創、易得，尿液中的OH-PAHs被廣泛用作生物標志物以綜合全面評價PAHs在人體暴露水平[9]。芘的代謝物1-羥基芘是最常用的PAHs職業接觸生物標志物，Shen等[10]將焦爐工人尿液中1-羥基芘作為PAHs內暴露標志物，評估了機體長期暴露于PAHs對炎癥反應和肺功能的影響；Bal等[11]通過尿液中1-羥基芘含量來評估瀝青道路鋪設工人暴露于PAHs對DNA氧化損傷的影響。但越來越多的研究顯示，聯合尿液中多種OH-PAHs能夠更全面評估人體暴露于PAHs的水平[12-14]。因此，建立簡單、快速測定尿液中多種OH-PAHs的方法對于PAHs暴露健康評價具有重要意義。

尿液中OH-PAHs的分析測定包括樣品前處理以及儀器分析兩個環節，其中儀器分析包括液相色譜-熒光法(HPLC-FLD)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[15-18]。由于尿液中待測物含量低，不易檢出，且尿液成分復雜，干擾測定，因此尿液樣品前處理成為儀器分析之前重要且關鍵的步驟。目前，測定尿液中OH-PAHs常用的前處理方法主要包括液液萃取法(Liquid-liquid extraction，LLE)[19]和固相萃取法(Solid-phase extraction，SPE)[12,20-21]。

固相支撐液液萃取法(Solid supported liquid-liquid extraction，SLE)是在傳統液液萃取法的基礎上，采用硅藻土作為吸附劑，利用其結構多孔、吸水性強、性質穩定等特點，從而在互不相溶的兩相實現快速微觀液液萃取的一種新型前處理方法[22-23]。與LLE相比，多孔的硅藻土表面能夠形成一層薄薄的液膜，提供了大的比表面積，從而提高了萃取效率；而與SPE相比，SLE避免了活化和淋洗步驟，操作簡化，且具有不易產生乳化現象的優點。目前，SLE已成功應用于食品、生物和環境等領域的樣品前處理。Seo等[24]采用SLE結合氣相色譜-串聯質譜法，建立了同時測定蘋果果汁、玉米等食品中7種N-亞硝胺的分析方法；Gao等[25]利用SLE結合超高效液相色譜-質譜法測定了血液中的雙甲脒及其代謝物；Wang等[26]建立了基于SLE結合氣相色譜法測定淡水魚及水體中共平面多氯聯苯的方法。

本研究將固相支撐液液萃取法用于尿液中OH-PAHs的前處理，并結合超高效液相色譜-串聯質譜法，建立了簡單、快速同時測定尿液中7種OH-PAHs的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LCMS-8060超高效液相色譜-串聯質譜儀(日本島津公司)；DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽(上海精宏實驗設備公司)；ET-3001氮吹濃縮儀(北京歐陸科儀進口儀器有限公司)；KQ-700GVDV型雙頻恒溫數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)；ISOLUTE?SLE+(1 mL)固相支撐液液萃取柱(北京綠綿科技有限公司)。

1-羥基萘(1-Hydroxy-naphthalene,1-OHNap)、2-羥基萘(2-Hydroxy-naphthalene,2-OHNap)、2-羥基芴(2-Hydroxy-fluorene,2-OHFlu)和9-羥基芴(9-Hydroxy-fluorene,9-OHFlu)(純度≥98.0%，北京Dikma科技有限公司)；2-羥基菲(2-Hydroxy-phenanthrene,2-OHPhe)、9-羥基菲(9-Hydroxy-phenanthrene,9-OHPhe)、2-羥基萘-D7(2-Hydroxy-naphthalene-D7,2-OHNap-D7)、2-羥基芴-D9(2-Hydroxy-fluorene-D9,2-OHFlu-D9)、1-羥基菲-D9(1-Hydroxy-phenanthrene-D9,1-OHPhe-D9)、1-羥基芘(1-Hydroxy-pyrene,1-OHPyr)、1-羥基芘-D9(1-Hydroxy-pyrene-D9,1-OHPyr-D9)(≥98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；β-葡萄糖醛酸酶-芳基硫酸酯酶水溶液(Type HP-2，≥100 000 unites/mL，美國Sigma-Aldrich公司)。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色譜純，美國Fisher公司)；甲基叔丁基醚、正己烷(色譜純，北京迪科馬科技有限公司)；石油醚、乙酸(分析純，上海阿拉丁試劑公司)；無水乙酸鈉(≥99%，天津市大茂化學試劑廠)。

1.2 標準溶液的配制

OH-PAHs標準儲備液：用甲醇配制濃度為1.0 g·L-1的上述7種OH-PAHs(2-OHNap、1-OHNap、9-OHFlu、2-OHFlu、2-OHPhe、9-OHPhe、1-OHPyr)以及4種同位素內標物(2-OHNap-D7、2-OHFlu-D9、1-OHPhe-D9、1-OHPyr-D9)的標準儲備液，于4 ℃避光保存。使用時，分別準確量取上述標準儲備溶液，使用甲醇稀釋成濃度為10.0 mg·L-1的標準工作液。

1.3 樣品的采集與制備

采集連續工作5天的河北省某企業無吸煙史的石油工人晨尿，于-80 ℃存儲。使用時，將尿液樣品自然解凍至室溫，混合均勻，準確量取5 mL于15 mL具塞離心管中，加入10 μLβ-葡萄糖醛酸酶-芳基硫酸酯酶混合水解酶液和20 μL混合內標溶液后，再加入5 mL 0.5 mol·L-1乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)。將以上混合液置于恒溫振蕩水槽中，37 ℃避光水解4 h后，于1 500 r·min-1離心10 min，取上清液于4 ℃儲存待用。另采集在校大學生晨尿，處理方法同上，作為非職業暴露人群對照樣品。

本實驗經華北理工大學醫學倫理委員會批準。

1.4 SLE流程

準確量取0.8 mL尿液樣品酶解液上樣至SLE萃取小柱，靜置5 min，使樣品完全吸附在支撐材料表面，隨后加入6 mL乙酸乙酯進行洗脫，收集洗脫液并氮吹至干后，用甲醇定容至200 μL并經0.22 μm微孔濾膜過濾。整個萃取過程需10 min。

1.5 UPLC-MS/MS分析條件

色譜柱為XR-ODS柱(100 mm×2.0 mm I.D.，2.2 μm，日本島津公司)，流動相為乙腈和水，采用梯度程序洗脫，20 min內乙腈的比例從5%線性增長至100%。流速為0.3 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫26 ℃。

采用電噴霧電離(ESI)源，多反應監測模式(MRM)采集，負離子(-)模式檢測，霧化氣流量為3 L·min-1，干燥氣流量10 L·min-1，加熱氣流量10 L·min-1，接口溫度300 ℃，脫溶劑溫度300 ℃，加熱塊溫度400 ℃，碰撞誘導解離氣體230 kPa。7種OH-PAHs以及4種同位素內標物的保留時間、母離子、子離子等參數見表1。

表1 7種OH-PAHs及4種同位素內標物的質譜參數Table 1 MS parameters of seven OH-PAHs and four isotope internal standards

2 結果與討論

2.1 固相支撐液液萃取條件的建立

OH-PAHs是一類極性化合物，常使用C18作為吸附劑的固相萃取法進行樣品前處理。固相支撐液液萃取能夠用于水相體系中極性化合物的有效前處理，不同于傳統的固相萃取法，固相支撐液液萃取過程僅有上樣和洗脫兩個步驟，其中洗脫步驟是影響方法準確度的關鍵因素，因此實驗考察了洗脫溶劑種類和體積對目標物回收率的影響。

圖1 洗脫溶劑種類對7種OH-PAHs回收率的影響(n=3)Fig.1 Effect of eluting solvent type on recoveries of seven OH-PAHs(n=3)

圖2 氮吹濃縮壓力對7種OH-PAHs回收率的影響Fig.2 Effect of nitrogen evaporation pressure on recoveries of seven OH-PAHs

在對照尿液基質樣品中加入7種OH-PAHs混合標準溶液，加標水平均為5 mg·L-1，固定上樣體積為0.8 mL，洗脫體積為6 mL，分別以甲基叔丁基醚、石油醚、正己烷和乙酸乙酯4種有機溶劑作為洗脫溶劑對目標物進行洗脫(n=3)，結果如圖1所示。乙酸乙酯對目標物的洗脫效果最佳，7種OH-PAHs的回收率均能達到90%以上，特別是對苯環數為2的2-OHNap和1-OHNap，平均回收率為96.6%～103%，說明SLE對所選目標物具有良好的萃取能力。為了節約溶劑，同時避免由于洗脫溶劑過多而引起的誤差，實驗對洗脫溶劑體積分別為5、6、7 mL時進行考察(n=3)。結果表明，當乙酸乙酯的體積由5 mL增至6 mL時，7種OH-PAHs的回收率增加；進一步增加洗脫體積，回收率降低，這是由于洗脫溶劑體積的增加延長了氮吹濃縮時間，造成了目標物損失。因此實驗最終選擇6 mL乙酸乙酯進行洗脫。對尿液樣品的整個SLE前處理過程僅需10 min，操作簡單、快速、省時。

2.2 氮吹濃縮條件的建立

氮吹濃縮是樣品前處理過程中必不可少的環節，也是影響目標物回收率的重要參數。實驗中，2-OHNap和1-OHNap易揮發，因此固定氮吹溫度為25 ℃，對氮吹濃縮壓力在20～55 kPa范圍內進行了考察。上樣體積為0.8 mL，使用6 mL乙酸乙酯進行洗脫，對7種OH-PAHs加標濃度均為5 mg·L-1的尿液樣品平行測定3次，由圖2可知，隨著氮吹壓力的升高，目標物的回收率也隨之增高，當氮吹壓力達到34 kPa，繼續增大氮吹壓力時，各化合物的回收率變化不大。然而，當氮吹壓力達到55 kPa時，回收率降低。因此實驗最終選擇最佳氮吹壓力為48 kPa。

2.3 方法驗證

2.3.1線性范圍、檢出限與定量下限在最優實驗條件下，配制一系列含7種不同濃度的OH-PAHs標準溶液按照實驗方法進行測定，每個濃度標準溶液中均含3mg·L-1的同位素內標溶液。采用同位素內標法定量分析，以目標物定量離子峰面積和內標物色譜峰面積的比值(y)對相應的目標物質量濃度(x，mg·L-1)進行線性分析，實驗結果見表2。7種OH-PAHs在0.3～3 000 mg·L-1范圍內線性關系良好，相關系數r≥0.995 1。

使用對照尿液樣品溶液逐級稀釋標準溶液，以定量離子信噪比S/N=3和S/N=10計算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得到7種OH-PAHs的LOD為0.05～1.0 mg·L-1，LOQ為0.15～3.0 mg·L-1(見表2)。

2.3.2回收率與相對標準偏差在對照尿液樣品中添加3個水平的7種OH-PAHs標準溶液進行加標回收實驗，日內(n=3)和日間(n=3)平行測定，計算平均回收率及相對標準偏差(RSD)。如表2所示，7種OH-PAHs在3個加標水平下的平均回收率為70.8%～117%，日內和日間RSD分別為3.7%～9.6%和3.7%～11%。方法具有良好的精密度和準確度。

表2 7種OH-PAHs的線性關系、檢出限、定量下限及回收率Table 2 Linear relationships,LODs,LOQs and recoveries of seven OH-PAHs

2.4 實際樣品的分析

在最優實驗條件下，將方法應用于10例石油工人尿液樣品與10例對照人群尿液樣品中7種OH-PAHs的測定，結果如表3所示。按OH-PAHs種類進行分類，兩組人群體內的7種OH-PAHs均有檢出，使用IBM SPSS 19.0軟件進行統計學分析，對7種OH-PAHs 的濃度值進行正態分布檢驗，結果均呈非正態分布，因此人群尿液中7種OH-PAHs的含量采用中位數和四分位數間距表示；石油工人與對照人群的差異性分析采用Mann-Whitney U檢驗(檢驗水準α=0.05)，除2-OHPhe和9-OHPhe外，石油工人尿液中5種OH-PAHs的濃度均高于對照人群濃度，差異具有統計學意義(p<0.05)。圖3為對照尿液樣品及加標樣品經SLE處理后的7種OH-PAHs的MRM圖。

表3 石油工人和對照人群尿液樣品中7種OH-PAHs的分析結果(n=10)Table 3 Seven OH-PAHs concentrations in human urine samples from petroleum workers and control group(n=10)

* no detected;** no value

2.5 與文獻方法的對比

將本方法對尿液樣品中OH-PAHs的測定結果與常用的前處理方法(如LLE、SPE)進行比較(表4)。結果顯示，本方法的準確度和靈敏度良好，回收率與文獻相當。此外，相比于LLE的試劑消耗量大，SPE的操作步驟繁瑣，SLE僅需上樣和洗脫兩步共10 min即可完成前處理工作，方法操作簡單快速，且消耗有機溶劑少，基質效應低。

表4 本研究與文獻報道方法的對比Table 4 Comparison of the developed method with the reported methods for determination of OH-PAHs in urine samples

3 結 論

本研究建立了基于SLE結合UPLC-MS/MS同時測定職業暴露工人尿液中7種OH-PAHs的分析方法。實驗對SLE過程中的洗脫步驟進行了優化，并考察了氮吹濃縮條件的影響。在最優條件下，7種OH-PAHs在0.3～3 000 mg·L-1范圍內線性關系良好，檢出限為0.05～1.0 mg·L-1，定量下限為0.15～3.0 mg·L-1，加標回收率為70.8%～117%。該方法簡單、快速，為尿液中多環芳烴代謝物測定提供了新思路，對環境中多環芳烴分析以及對人體健康評價具有重要意義。